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Studi di associazione caso-controllo Dr.ssa Francesca Gensini.

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Presentazione sul tema: "Studi di associazione caso-controllo Dr.ssa Francesca Gensini."— Transcript della presentazione:

1 Studi di associazione caso-controllo Dr.ssa Francesca Gensini

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3 Frequenza di tipi diversi di malattie genetiche Tipo di malattiaIncidenza alla nascita (per 1000) Prevalenza a 25 anni di età (per 1000) Prevalenza a tutte le età (per 1000) Mutazioni genomiche o cromosomiche 61,83,8 Mutazioni ad un singolo gene 103,620 Eredità multifattoriale  50  600 Fonte: Rimoin, Connor, Pyeritz (1997) Emery and Rimoin’s Principles of Medical Genetics, 3 ed. Churchill Livingstone, Edinburgh

4 MALATTIE MULTIFATTORIALI Originano dall’interazione tra più fattori genetici predisponenti e fattori ambientali - molto più frequenti delle malattie mendeliane monogeniche - rappresentano una delle maggiori cause di morbilità cronica e di mortalità nella popolazione generale  importanza dello studio dei fattori genetici predisponenti per: -migliore conoscenza dei meccanismi patogenetici coinvolti -migliori approcci terapeutici

5 Fattori complicanti l’analisi delle componenti genetiche dei caratteri multifattoriali Diversi loci implicati, perlopiù con effetto “debole” Eterogeneità genetica: esistenza di differenti mutazioni (anche in geni diversi) che causano fenotipi simili Scarsa conoscenza ed eterogeneità di esposizione ai fattori ambientali

6 STRATEGIE PER L’IDENTIFICAZIONE DEI GENI IMPLICATI NELLA GENESI DEI CARATTERI MULTIFATTORIALI Studi di associazione (caso/controllo) generalmente impiegati per testare l’ipotesi del coinvolgimento di geni candidati* nella suscettibilità ad una malattia *geni che codificano per proteine di cui si conosca o si sospetti un coinvolgimento nel processo patologico Analisi di linkage (famiglie) generalmente impiegati per la ricerca di nuovi geni

7 Problemi degli studi di linkage nelle mal. multifattoriali 1- difficoltà di trovare famiglie numerose e con vari casi per l’insorgenza tardiva delle malattie e alta mortalità 2- poco efficaci nell’identificazione di varianti genetiche con effetto debole 3- rispetto alle malattie monogeniche deve essere studiato un maggior numero di famiglie con un alto numero di marcatori del DNA

8 Dagli studi di linkage all’identificazione dei geni di suscettibiltà…  Esame più in dettaglio delle regioni cromosomiche identificate: sono molto ampie e contengono centinaia di geni: ciascuno di essi potrebbe essere il responsabile  Aumentare il numero di famiglie studiate Analisi combinata dei dati di diversi gruppi di ricerca  Studio di individui affetti con anomalie cromosomiche che coinvolgono queste regioni  Studio di geni candidati  Studi di associazione allelica / Linkage disequilibrium mapping

9 STUDI DI ASSOCIAZIONE (CASO/CONTROLLO) (i più utilizzati nello studio delle mal.multifattoriali) Si utilizzano singoli soggetti (non sono necessari nuclei familiari) studio di 2 popolazioni distinte di soggetti: 1- CASI:presenza della malattia 2- CONTROLLI: assenza della malattia

10 Identità genetica umana 99.9% di identità genomica 0.01% di differenze interindividuali (polimorfismi)

11 LOCUS: regione cromosomica unica che corrisponde ad un gene o a qualche altra sequenza di DNA ALLELE: una o più forme alternative di un gene o di una sequenza di DNA

12 Eterozigote: individuo con alleli diversi allo stesso locus (CT) Omozigote: individuo con alleli identici ad uno stesso locus (CC o TT) Genotipo: costituzione genetica di un individuo o più specificamente gli alleli presenti ad ogni particolare locus Mutazione: alterazione della sequenza nucleotidica di una molecola di DNA Polimorfismo: variazione della sequenza nucleotidica di un gene, senza effetto fenotipico, che esiste nella popolazione con una frequenza di almeno l’1%

13 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) GATTTAGATCGCGATAGAG GATTTAGATCTCGATAGAG Il più comune tipo di polimorfismo Più di 10 milioni di SNPs nell’uomo

14 SNPs Nelle regioni codificanti: -causa di malattia mendeliana se alterano la funzione o la struttura della proteina -importanti in farmacogenomica se alterano la struttura di una proteina coinvolta nel metabolismo di un farmaco -causa di mutazioni missenso in regioni codificanti possono aumentare il rischio di ammalarsi per patologie comuni Nelle regioni con elementi regolatori: -alterando la trascrizione possono essere associati ad un aumento del rischio per patologie comuni Nelle regioni non codificanti: -non hanno impatto diretto sul fenotipo dell’individuo, utili negli studi di popolazione

15 Disease Control Allele 1Allele 2 Marker A is associated with Phenotype Marker A: Allele 1 = Allele 2 = STUDI DI ASSOCIAZIONE: confronto della frequenza di un polimorfismo tra un gruppo di casi e un gruppo di controlli

16 pazienti controlli A G Distribuzione allelica Test chiquadrato=3.935 p=0.04 O.R Esempio: Polimorfismo A/G (genotipi AA-AG-GG) Se un particolare allele mostra una frequenza maggiore nei casi rispetto ai controlli vi è evidenza di associazione

17 “a”= numero dei pazienti con l’allele X, “b”= numero dei controlli con l’allele X, “c”= numero dei pazienti senza l’allele X, “d”= numero dei controlli senza l’allele X. Si calcola quanto maggiore è la probabilità di avere l’allele X piuttosto che non averlo per i pazienti (a/a+c):(c/a+c) = a/c, rispetto a quanto minore sia la probabilità di avere l’allele X piuttosto che non averlo per i controlli (b/b+d):(d/b+d) = b/d. OR= a/c : b/d = ad/bc Il valore ottenuto indica la forza dell’associazione e può assumere valori da 0 a +∞. OR=1 indica che non c’è associazione. PazientiControlli Allele X presenteab Allele X assentecd CALCOLO DELL’ODDS RATIO (O.R.)

18 pazcontrolli A/A A/G G/G X 2 =8,548 2df, p= Distribuzione dei genotipi

19 Studi che confrontano la frequenza di un polimorfismo tra un gruppo di interesse (pazienti; soggetti con determinati tratti fenotipici) e un gruppo di controllo Quando una variante allelica è più frequente nei casi rispetto ai controlli, si dice che è “associata” con il fenotipo.

20 Cause di associazione allelica 1.Effetto diretto della variante genetica sul fenotipo 2. La variante può essere vicina (in linkage disequilibrium*) ad un’altra variante responsabile del fenotipo. 3.Associazioni “spurie” dovute a diversi eventi: per es. presenza di stratificazione nella popolazione marcatore Allele di suscettibilità

21 Aplotipo: particolare combinazione di varianti alleliche in una specifica regione di un cromosoma

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23 Soggetto 1AGSoggetto 1AG Soggetto 2AGSoggetto 2AC Soggetto 3AGSoggetto 3AC Soggetto 4AGSoggetto 4AG Soggetto 5TCSoggetto 5TC Soggetto 6TCSoggetto 6TG Soggetto 7TCSoggetto 7TG Soggetto 8TCSoggetto 8TC SNP1 SNP2 LINKAGE DISEQUILIBRIUM LINKAGE EQUILIBRIUM

24 STUDI DI ASSOCIAZIONE: LIMITI 1- selezione dei pazienti 2-selezione dei controlli (  transmission disequilibrium test) 3- risultati discordanti nelle diverse popolazioni per diverso background genetico 4- necessità di un campione molto numeroso 5- link biologico tra gene candidato e patologia 6- possibilità di testare solo un polimorfismo già conosciuto 7- assenza di associazione non esclude il gene candidato 8- necessità di analizzare > 1 polimorfismo 9- necessità di analisi statistica adeguata

25 Studi di associazione con controlli interni: TDT: test di disequilibrio della trasmissione (transmission disequilibrium test) si analizza il probando + 2 genitori (problema per le malattie ad esordio tardivo) si propone di identificare la trasmissione preferenziale di un dato allele (X) nei figli affetti di famiglie nucleari (padre-madre-figlio) si selezionano i genitori eterozigoti per l’allele X se un allele predispone alla malattia o è in linkage-disequilibrium con l’allele-malattia, si osserverà una trasmissione preferenziale di tale allele nei figli affetti quale popolazione di controllo viene utilizzata la “popolazione” dei cromosomi non trasmessi ai figli affetti dai propri genitori occorre analizzare il 50% di soggetti in più rispetto ai normali test di associazione

26 Mendel’s law : Each parental allele carried by an autosome has an equal probability (i.e. 0.5) to be transmitted to an offspring a/bc/d a/c

27 Frequency of transmission of allele a : F a = 6/12= 0.5 Transmission of an autosomic multiallelic polymorphism in trios a/bc/d a/c a/db/d a/d b/ba/d b/a c/bc/a c/c a/bc/d b/c a/cc/d b/cc/d a/d a/c a/ba/d c/d a/ba/d a/aa/a

28 Allele a is transmitted with a frequency : F a = 10/12= 0.83 (p < 0.038) Transmission disequilibrium in affected offsprings a/bc/d a/c a/db/d a/d b/ba/d b/a c/bc/a a/aa/ac/d a/c c/d a/d a/aa/a c/ba/d c/a a/ba/d a/aa/a Phenocopy (Fenotipo causato da fattori ambientali che mimano nel risultato un carattere geneticamente determinato)

29 The A allele is transmitted to affected offspring four times out of five. Studi di associazione con controlli interni: Transmission disequilibrium test

30 esempio

31 PATOLOGIA VASCOLARE disfunzione endoteliale attivazione piastrinica attivazione della coagulazione modificazioni del flusso ematico Fattori di rischio classici : - ipertensione, diabete,fumo, iperlipidemia - intervento chirurgico, immobilizzazione, gravidanza, ter. estroprogestinica Fattori di rischio emergenti : ……… fattori genetici alterazione della fibrinolisi Scelta di geni candidati

32 SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA E NITROSSIDO Nitrossido sintasi Bradichinina Nitrossido peptidi inattivi Angiotensinogeno Angiotensina I Angiotensina II Renina ACE - vasodilatazione -  proliferazione c.m.l.vasali -  adesione e aggregazione piastrinica -  espressione Fattore Tissutale -  adesione leucociti all’endotelio - vasocostrizione -  proliferazione c.m.l.vasali -  adesione e aggregazione piastrinica -  espressione Fattore Tissutale -  produzione t-PA -  produzione di PAI-1  coinvolgimento di: endotelio, coagulazione, piastrine, fibrinolisi, flusso ematico

33 Gene eNOS: polimorfismo T-786 C (promotore) 5’ T G G C G G C T 3’ T G G C T 3’ 5’ C T G G C Nae I T-786C   attività del promotore (Nakayama M et al., Circulation 1999) Gene eNOS: polimorfismo G894T (ex. 7) 5’ A T G A C C C C 3’ G G A C C C C 3’ 5’ Mbo I A TT G894T   attività enzimatica   produzione basale di nitrossido (Veldman BA et al., J Hypertension 2002) b: variante comune (5 tandem repeats di 27 bp) a: variante rara (4 tandem repeats di 27 bp) 4a/4b   livelli plasmatici di nitrossido ( Wang XL. et al., ATVB 1997) Gene eNOS: polimorfismo 4a/4b (int. 7)

34 METODI Estrazione di DNA genomico da sangue periferico Amplificazione mediante PCR Digestione con enzimi di restrizione ANALISI STATISTICA Conta diretta Test chi-quadrato Analisi di regressione multipla T-test, analisi della varianza p<0,05 considerato statisticamente significativo

35 478 pazienti con cardiopatia ischemica M=69.5%, F=30.5%; età 68 (26-87) Infarto miocardico n=224 (47%), Angina n=254 (53%) Mal. monovasale n=217 (45%), Mal. plurivasale n=261 (55%) 538 controlli M=68.8%, F=31.2%; età 66 (33-89) Fattori di rischio classiciPazientiControlli Ipertensione57.3%30.1% Dislipidemia52.5%19.9% Diabete29.5%3.9% Fumo48.9%21.6% Familiarità33.2%17.5%

36 polimorfismo T-786C gene eNOS CC CC TC TC allele C allele C 60% 40% 20% 80%  Pazienti  Controlli p< p< TT TT

37 polimorfismo G894T gene eNOS TT TT GT GT allele T allele T 60% 40% 20% 80%  Pazienti  Controlli p=0.02 p=0.01 GG GG

38 polimorfismo 4a/4b gene eNOS 4a4a 4a4a4a4b allele 4a allele 4a 60% 40% 20% 80%  Pazienti  Controlli p=0.005 p=0.02 4b4b 4b4b

39 Odds ratio (IC95%) 1.7 ( ) p< CC vs TC+TT 0 894TT vs GT+GG 1.6 ( ) p= ( ) p=0.04 4a4a vs 4a4b+4b4b 1.4 ( ) p=ns -786CC vs TC+TT 894TT vs GT+GG 2.5 ( ) p=0.02 4a4a vs 4a4b+4b4b 1.5 ( ) p=ns Analisi univariata Analisi Multivariata* *Corretta per ipertensione, dislipidemia, fumo, diabete 4a4a vs 4a4b+4b4b 3.6 ( ) p=0.03 4a4a vs 4a4b+4b4b 1.4 ( ) p=0.5 Infarto Angina 4a4a / -786CC 6.1 ( ) p=0.02

40 Disease Population N=500 Matched Control Population N= ~3,000,000 common SNPs across genome Representing every gene P value 122 Informatics to identify gene(s) mapped to associated SNP Regions of association Chromosomal Location Whole Genome Associations

41 Caratterizzazione di nuovi SNPs + sviluppo di nuove tecnologie Obiettivo: ridurre il numero totale degli SNP da analizzare mantenendo un potere analitico sufficiente 2 approcci: 1- analisi limitata ai SNP localizzati all’interno di sequenze codificanti 2- esplorare indistintamente regioni geniche e intergeniche

42 Basato sull’assunto che le varianti genetiche che influenzano la suscettibilità a malattie genetiche dovrebbero determinare effetti funzionali sulla proteina Numero di SNPs da analizzare ~ MA:. Selezione degli SNPs sulla base degli effetti funzionali non ancora completata. Molte varianti hanno bassa frequenza e quindi sarebbe necessario aumentare la dimensione del campione da studiare 1- analisi limitata ai SNP localizzati all’interno di sequenze codificanti

43 2- esplorare indistintamente regioni geniche e intergeniche Sfrutta l’esistenza dei blocchi di linkage disequilibrium L’analisi è ridotta ai soli haplotype tagging SNPs (~ ) Circa il 65-85% del genoma umano è organizzato in blocchi inscindibili di oltre 10000bp. Ciascuno di questi blocchi aplotipici può contenere 12 o più SNPs che tenderanno ad essere trasmessi insieme nelle generazioni. Si cerca di determinare per ciascun blocco, gli SNPs (tagSNPs) che lo identificano

44 L’associazione di uno di questi blocchi, identificato per mezzo dei suoi tagSNPs, e una data patologia, rivelerebbe in quale regione del genoma ricercare il gene responsabile della suscettibilià alla malattia in esame MA:. maggior numero di SNP da analizzare. è fondamentale che i blocchi aplotipici siano definiti nelle popolazioni cui appartengono i campioni in esame

45 MALATTIE INFIAMMATORIE INTESTINALI  Morbo di Crohn  Colite Ulcerosa  Forme miste

46 MALATTIE INFIAMMATORIE INTESTINALI Evidenze in favore del coinvolgimento di fattori genetici - Concordanza in gemelli (dati del Registro Svedese): CD: 8/18 MZ e 1/26 DZ concordanti CU: 1/16 MZ e 0/20 DZ concordanti -Familiarità: s per CD (rischio relativo generico per IBD, in particolare per CD), 8-10 per CU -Prevalenza elevata in particolari gruppi etnici: negli Ebrei Ashkenaziti CD 2-8X rispetto alla popolazione generale (40-250/ per CD; / per IBD nel complesso)

47 Genetica del Morbo di Crohn (CD) Hugot et al. Nature 379: , 1996  Analisi di linkage “genome-wide”  Due pannelli di famiglie con CD puro:  pann.1: 25 fam.  pann.2: 53 fam.  Dimostrata evidenza di linkage con marcatori della regione pericentromerica del cromosoma 16 in entrambi i pannelli (nel primo pannello anche linkage con un marcatore del cromosoma 1, non confermato nel secondo)

48 Analisi della condivisione di alleli tra coppie di fratelli CD (ASP) Locus D16S24 SPN D16S409 D16S419 D16S408 D16S514 D16S503 D16S421 Fraz. media alleli condivisi T-test p >0.05 Hugot et al. Nature 379: , 1996

49 Morbo di Crohn e cromosoma 16 Locus D16S D16S411 D16S419 D16S769 D16S409 D16S D16S753 D16S408 D16S411 Fraz. media alleli condivisi LOD Score Multipoint p Autori Hugot et al Ohmen et al Parkes et al Mirza et al Brant et al Cavanaugh et al Curran et al Rioux et al Annese et al Vermeire et al IBD Int. Genet. Cons. 2001

50 Morbo di Crohn e Gene NOD2/CARD15 (Hugot et al. Nature 411: Ogura et al. Nature 411: ) Mappatura fine della regione IBD1 sul cromosoma 16 in 235 famiglie (Hugot) Evidenza di linkage disequilibrium tra nuovi marcatori della regione e CD Identificazione di polimorfismi associati a CD mediante Pedigree-Disequilibrium Test (PDT) I polimorfismi associati sono localizzati all’interno del gene NOD2/CARD15 Analisi diretta del gene candidato NOD2/CARD15 (Ogura)

51 Gene NOD2/CARD15 Costituito da 12 esoni Proteina di 1013 aminoacidi Elevati livelli di espressione nei leucociti Non espresso nel colon e nell’intestino tenue NOD: famiglia di geni regolatori dell’apoptosi CARD: CAspase Recruitment Domain Attiva il fattore nucleare NF-kB Recettore di componenti di batteri patogeni (lipopolisaccaride)

52 Frequenze alleliche di 3 varianti di NOD2/CARD15 associate con CD Hugot et al. Nature 411: Gruppo Non affetti UC CD N. cromosomi SNP SNP SNP Totale

53 Frequenze dei genotipi NOD2/CARD15 e rischi associati Hugot et al. Nature 411: Gruppo Non affetti UC CD Rischio di CD Relativo Assoluto Eterozigoti semplici x Omozigoti x Eterozigoti composti x Nessuna variante x 10 -4

54 NOD2/CARD15 e morbo di Crohn SNP8: 2023C>T - R675W SNP12: 2641 G>C - G1881R SNP13: 2936insC – 980fs981X (frame shift) Riscontrata associazione di CD anche con varianti più rare di CARD15 (19% delle varianti associate) Correlazioni con caratteristiche cliniche in omozigoti o eterozigoti composti: –tendenza ad età più precoce d’insorgenza –fenotipo stenosante più frequente –coinvolgimento del colon meno frequente

55 Il Morbo di Crohn come Modello dell’Approccio alle Basi Genetiche dei Caratteri Multifattoriali Selezione di un fenotipo omogeneo Malattia relativamente rara  minor grado di eterogeneità genetica? Identificazione di famiglie con casi multipli idonee per analisi di linkage con metodi tradizionali Conferma del linkage con cromosoma 16 mediante analisi della segregazione in coppie di fratelli Risultati degli studi di associazioni replicati in diverse casistiche Il gene identificato è associato a rischi relativamente elevati (in rapporto all’incidenza della malattia)

56 MORBO DI CROHN Cromosoma 16 ASSOCIAZIONE MICROSATELLITI ASSOCIAZIONE SNP p<.05 LINKAGE : GENOMIC SCREEN (microsatelliti) SNP8 - 11% vs 4% SNP12 - 6% vs 1 % SNP % vs 2 % Hugot et al. Nature

57 A1 A2 A3 A4 A5 B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 C3 C4 C5 D1 D2 D3 D4 D5 ENV1 ENV2 FENOTIPO MALATI: -A1B3C1D1ENV1 -A3B1C2D1ENV2 -A1B1C1D2 -A2B2C1D1ENV1 -A2B2C1D5ENV1ENV2 -ECC., ECC.

58 CONSULENZA GENETICA Rischio empirico – misura statistica derivata da studi osservazionali di popolazione È la frequenza di un evento (condizione, patologia) osservata in una popolazione Il rischio empirico per un individuo aumenta con: - la gravità della condizione - numero di familiari affetti - grado di parentela con i familiari affetti

59 Malattie autosomiche dominanti. Rischio riproduttivo relativo a: A) soggetto eterozigote e partner normale B) entrambi i soggetti eterozigoti

60 Malattie autosomiche recessive: probabilità di trasmissione dell’allele mutato e relativo rischio riproduttivo: entrambi genitori eterozigoti.

61 Malattie a trasmissione X-linked. Rischi riproduttivi relativi a: A) femmina eterozigote e maschio emizigote normale

62 PREVISIONI DEL MODELLO SOGLIA MULTIFATTORIALE PER RISCHIO DI RICORRENZA DI MALATTIE POLIGENICHE O MALFORMAZIONI Previsioni diverse da quelle dell’eredità mendeliana 1-I rischi di ricorrenza rappresentano il rischio medio e varieranno da famiglia a famiglia 2-Il rischio aumenta con l’aumentare del numero di parenti affetti (differenze rispetto all’eredità mendeliana)

63 PREVISIONI DEL MODELLO SOGLIA MULTIFATTORIALE PER RISCHIO DI RICORRENZA DI MALATTIE POLIGENICHE O MALFORMAZIONI 3- Il rischio aumenta con la gravità della malformazione o della malattia: più grave è il difetto maggiore è la sistemazione dell’individuo affetto ulteriormente sulla destra della curva di distribuzione 4- Il rischio relativo per i parenti di un probando affetto aumenta se la frequenza della malattia o malformazione nella popolazione generale diminuisce: maggiore è l’incidenza di una malformazione nella popolazione generale, più bassa si pensa sia la suscettibilità genetica, risultando in una piccola differenza tra la suscettibilità genetica media della popolazione in generale e quella degli individui affetti

64 PREVISIONI DEL MODELLO SOGLIA MULTIFATTORIALE PER RISCHIO DI RICORRENZA DI MALATTIE POLIGENICHE O MALFORMAZIONI 5- Quando il rapporto maschi/femmine dei probandi affetti devia significativamente dall’unità, la prole dei probandi affetti appartenenti al sesso meno frequentemente affetto sono a più alto rischio relativo Lussazione congenita dell’anca: sei volte più comune nelle femmine rispetto ai maschi. Il rischio di ricorrenza nella prole dei maschi affetti è più alto che per le femmine affette Contrasto con l’eredità autosomica dominante o recessiva, in cui il sesso del probando affetto non influisce sul rischio di ricorrenza degli altri membri della famiglia

65 L’eredità dei caratteri complessi Consanguineo affetto EsempioRischio di ricorrenza Di primo gradoGenitore, fratello 3,2 Di secondo grado Nipote, zio0,5 Di terzo gradoCugino di primo grado, prozio 0,17

66 Rischio di ricorrenza in alcune malformazioni congenite MalformazioneIncidenza nella popolazione Rischio di ricorrenza nei consanguinei di primo grado (%) Labioschisi e/o palatoschisi 1/10004,9 Lussazione dell’anca1/10003,5 Stenosi pilorica1/5003,2 Piede equino1/10002,8

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68 RISCHI EMPIRICI DI RICORRENZA


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