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FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII ANALISI GENICHE L’isolamento e la quantificazione di sequenze di acidi nucleici e lo.

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1 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII ANALISI GENICHE L’isolamento e la quantificazione di sequenze di acidi nucleici e lo studio della loro organizzazione, localizzazione, ed espressione è reso possibile da: - marcatura di acidi nucleici per produrre DNA/RNA sonda - fenomenmo dell’ibridazione La ricerca di specifiche sequenze geniche ha una grande importanza in ambito clinico e diagnostico in quanto l’identificazione della sequenze genica associata ad un determinato effetto permette di individuarne le cause.

2 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Struttura secondaria del DNA: doppia elica con uno scheletro idrofilo zucchero- fosfato e basi idrofobiche impacchettate perpendicolarmente all'asse dell'elica. I due filamenti di DNA complementari si sviluppano in direzione opposta. Struttura primaria del DNA: sequenza di basi nucleotidiche (adenina, guanina, citosina, timina) contenente l’informazione genetica, legate fra di loro attraverso i ponti della catena zucchero-fosfato. DNA

3 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Stabilità del DNA: La doppia elica è stabilizzata dalla formazione di legami ad idrogeno tra le basi presenti sui filamenti opposti secondo lo schema A-T e G-C: DNA

4 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI IN VIVO: alla base dei processi di riconoscimento molecolare IN VITRO: l’ibridazione di sequenze target con sonde oligonucleotidiche è l’approccio tipico per l’identificazione e l’isolamento di acidi nucleici Denaturazione del DNA target con trattamento termico per rompere i legami H Mix frammenti sonda + target per far avvenire l’appaiamento di sequenze complementari

5 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Sonda genica

6 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Tm = temperatura alla quale il 50% del DNA (o ibrido) è presente in forma denaturata; cioè come singolo filemanto È un indice della stabilità del legame chimico La denaturazione del Dna provoca una variazione delle proprietà spettroscopiche STABILITA’ DELL’IBRIDO Temperatura di melting Tm

7 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII L’ENERGIA necessaria per separare due filamenti complementari di DNA dipende da: LUNGHEZZA dei filamenti COMPOSIZIONE di basi azotate (la coppia GC possiede un legame idrogeno in più rispetto alla coppia AT, quindi filamenti ricchi in GC richiedono maggiore energia per esser separati)  COMPLEMENTARIETA’ delle catene di DNA: catene non perfettamente complementari fra di loro (con una o più basi “mismatched”) si legano ugualmente, ma con energia minore. AMBIENTE CHIMICO (la presenza di cationi monovalenti quali Na + stabilizza la doppia elica, i denaturanti quali urea e formamide la destabilizzano) IBRIDAZIONE  K = e -  G(complementare/non complementare)/RT  G(complementare/non complementare)~4 kcal/mol  K ~ 1/100-1/1000

8 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII REAZIONI D’IBRIDAZIONE La sensibilità delle reazioni di ibridazione è molto elevata (costante di associazione delle sonde = /mole) La specificità delle reazioni di ibridazione è alta. Per la rivelazione delle reazioni d’ibridazione occorre marcare il DNA sonda. I metodi di marcatura degli acidi nucleici prevedono l’incorporazione di nucleotidi marcati nel DNA, mediante reazioni enzimatiche o durante il processo di sintesi. La reazione d’ibridazione procede con una cinetica del secondo ordine a due stadi.

9 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Una Sonda di DNA (RNA) è un frammento di DNA/RNA marcato che viene utilizzato per identificare sequenze specifiche di acidi nucleici Le sonde sono di diverse dimensioni: oligomeri (contenenti meno di 50 basi) o frammenti di alcune migliaia di nucleotidi. Può essere a singolo o a doppio filamento, anche se prima di esser usata viene convertita a singolo filamento SONDE GENICHE

10 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Le sonde radioattive, sonde “calde”, contengono nucleotidi in cui è inserito un radioisotopo (es. 32 P, 35 S, 3 H) che viene individuato in soluzione o tramite autoradiografia RadioisotopoEmivitaTipo di emissione/Energia 3H3H12.4 anni  - / MeV 32 P14.3 giorni  - / 1.71 MeV 35 S87.4 giorni  - / MeV MARCATURA ISOTOPICA Le sonde “calde” sono le più sensibili. Attraverso la marcatura diretta, Il marcatore è legato covalentemente direttamente all’acido nucleico, o intercala con legami non covalenti direttamente tra la doppia elica del DNA sonda.

11 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII MARCATURA NON ISOTOPICA Composti chemiluminescenti: luminolo e derivati Enzimi: fosfatasi alcalina, luciferasi batterica o da lucciola, HRP, … Inibitori enzimatici: acido fosfonico Composti fluorescenti: fluorescina, rodamina, chelati di europio Fotoproteine: acquorina Le sonde non radioattive sono dette sonde “fredde”. La marcatura Non radioattiva può essere diretta o indiretta. I vari tipi di marcatori sono:

12 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII MARCATURA NON ISOTOPICA La marcatura enzimatica permette l’amplificazione del segnale, la luminescenza permette di sviluppare metodi sensibili per la rivelazione di quantità piccole di acidi nucleici. Per metodi basati sull’utilizzo di sonde più lunghe di 300 basi, la marcatura diretta con AP o HRP è consigliata, in questo modo la formazione dell’ibrido è rivelata semplicemente aggiungendo il substrato chemiluminescente per l’enzima. CL molecule product target sequence enzyme gene probe MARCATURA DIRETTA

13 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII MARCATURA NON ISOTOPICA MARCATURA INDIRETTA La marcatura con apteni permette sempre lo sviluppo di sistemi amplificati (es. biotina-avidina, biotina-streptavidina) Sonde geniche di piccole dimensioni sono spesso marcate indirettamente con apteni che sono poi immunorivelati attraverso anticorpi anti-aptene marcati con l’enzima anti-hapten antibody hapten

14 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII MARCATURA NON ISOTOPICA ApteneProteina legante Marcatore della proteina Biotina Avidina Streptavidina (K aff ) Fosfatasi alcalina b-galattosidasi fluorescina HRP DigossigeninaAntidigossigeninaFosfatasi alcalina IgGAntispecie IgG Horseradish peroxidase Poly (dA)Poly (dT)HRP

15 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Una scoperta relativamente recente che permette la rivelazione di specifiche sequenze geniche è rappresentata dai “molecular beacons”. Esse sono sonde oligonucleotidiche che rivelano la presenza di una specifica sequenza target (DNA o RNA) attraverso l’emissione di un intenso segnale fluorescente a seguito della reazione di ibridizzazione. I “molecular beacons” sono oligonucleotidi a filamento singolo con struttura “STEM- LOOP”,Alle estremità della porzione “STEM” sono legate rispettivamente una molecola fluorescente ed un “quencher”. LOOP STEM fluoroforo “quencher” sequenza target MARCATURA NON ISOTOPICA

16 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Colorimetry. Colorimetric assays produce soluble colored products and are relatively insensitive compared to luminescent assays; simple visual read-out Fluorescence and time-resolved fluorescence. Capable of detecting single molecules of fluorescein; High background signal due to nonspecific fluorescence present in biological samples Since the background fluorescence tends to be short- lived, it can be avoided by using a short lived fluorophore, e.g. europium chelate Electrochemiluminescence. An electrochemical reaction produces excited-state species that decay to produce ground state product and light; need for specialized equipment that combines electrochemical-generation and light-detection capabilities RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI METODI DI RIVELAZIONE

17 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Chemiluminescence and Bioluminescence. Chemiluminescence is the emission of light that occurs in certain chemical reactions because of decay of electronic excited molecules to the ground state; bioluminescence is the chemiluminescence of nature (e.g. the firefly photinus pyralis) Both methods are very sensitive (zeptomole amounts, moles) rapid and versatile (adaptable for hybridization in solution and on membranes and monitoring with Charge Coupled Device cameras). Phosphorescence. Long-lived emission from triplet excited states (e.g. inorganic phosphor crystals); Irradiation with ultraviolet light results in a long-lived signal (milliseconds to microseconds); Signal acquisition using photographic film or a CCD camera RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI METODI DI RIVELAZIONE

18 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Aequorin(apoaequorin produced by recombinant DNA techniques is converted to aequorin (the photoprotein present in the jellyfish Aequora) by reaction with coelenterazine and light emission from aequorin is triggered by calcium ions, light is emitted as a flash (469 nm) Alkaline Phosphatase Chemiluminescent: AMPPD (adamantyl 1,2-dioxetane aryl phosphate) is dephosphorylated to a phenoxide intermediate which decomposes to form adamantone and an exited-state aryl- ester, which emits light as a protracted glow Bioluminescent: firefly luciferin O-phosphateluciferin Colorimetric, time-resolved fluorescent AP RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI ESEMPI DI MARCATORI

19 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Europium chelates: lanthanides, e.g. europium 3+ and terbium 3+ form highly fluorescent chelates with naphthoyltrifluoracetone. Long-lived fluorescence ( us) Fluorescein: (quantum yield bigger than 0.85) used in nonseparation energy transfer probe assays Glucose-6-phosphate dehydrogenase: used with marine bacterial luciferase NAD(P)H:FMN oxidoreducatse reaction Horseradish peroxidase: catalyzes the chemiluminescent oxidation of luminol and, in the presence of small amounts of phenols and amines the analytical features of this reaction are enhanced. The light emission from this reaction is a long-lived glow (>30 min) RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI ESEMPI DI MARCATORI

20 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Luminol and Isoluminol: metal ions and peroxidases catalyze the chemiluminescent oxidation of luminol and isoluminol Phosphors. protein A can be labeled with red-emitting yttriumoxisulfide or green-emitting zinc silicate phosphors (southern and dot blots). Phosphorescence signal is not influenced by the presence of water, pH or changes in temperature Renilla Luciferase: catalyzes the bioluminescent oxidation of coelenterazione. Light is emitted as a glow Xanthine oxidase: catalyzes the luminescent oxidation of luminol. Long-lived light emission (lasting for several days) is enhanced by an iron-EDTA complex via hydroxyl radical production RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI ESEMPI DI MARCATORI

21 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII TECNICHE DI IBRIDAZIONE Le reazioni d’ibridazione sono reazioni bimolecolari fra una molecola “target” ed una molecola “sonda” in cui catene complementari di acidi nucleici si associano a formare molecole a doppia catena sulla base della complementarietà di sequenza. L’ibridazione può avvenire: - in soluzione - in fase mista (ibridazione su filtro) - in situ

22 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE Questo tipo di reazione d’ibridazione è il più efficace. Sono state ideate tecniche che prevedono la cattura dell’ibrido formatosi in soluzione su un supporto solido; generalmente la sonda contiene un ligando, tipo biotina che permette la cattura su un supporto solido. Es: PCR-ELISA Sonda biotinilata + Micropiastra streptavidinata

23 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII streptavidina 3- quindi l’ibrido è catturato su piastre ricoperte di streptavidina. 1- Il DNA bersaglio viene marcato con un aptene appropriato 2- Quindi l’ibridazione con un DNA sonda marcato con biotina avviene in soluzione, target DNA hapten IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE anti-hapten antibody 4- Quindi gli ibridi sono rivelati attraverso l’uso di un anticorpo anti-aptene coniugato con un enzima e l’aggiunta del substrato opportuno.

24 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII IBRIDAZIONE SU FILTRO I filtri utilizzati possono essere di materiale diverso. Tra i più usati ci sono: -Nitrocellulosa -Nylon -Nylon carico positivamente L’ibridazione su filtro prevede 5 passaggi: 1)fissaggio dell’acido nucleico denaturato su filtro; 2)preibridazione per bloccare i siti sulla membrana; 3)ibridazione, si fa incubare la membrana con la sonda marcata; 4)lavaggi, per rimuovere l’eccesso di sonda; 5)rivelazione dell’ibrido in base al tipo di sonda marcata usata. Le principali tecniche d’ibridazione su filtro sono: - “southern Blotting” - “Dot-Blot” - “Reverse dot-blot”

25 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Per un’analisi di Southern Blotting: Il DNA è isolato da cellule o tessuti e diviso in fgrammenti di diverse dimensioni con enzimi che tagliano il DNA a siti specifici. I vari frammenti sono separati in base alla dimensioni mediante elettroforesi su gel. I frammenti sono poi denaturati per ottenere I singoli filamenti che devono reagire con le sonde complementari. I singoli frammenti sono trasferiti su una membrana di nitrocellulosa e analizzati per ibridazione con una sonda marcata La sonda che non ha reagito è eliminata tramite lavaggi RNA – Northern Blotting Protein – Western Blotting IBRIDAZIONE SU FILTRO

26 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII IBRIDAZIONE SU FILTRO

27 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII ELETTROFORESI SU GEL

28 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII IBRIDAZIONE SU FILTRO La tecnica Dot-Blot è simile alla Southern Blot in termini di utilizzo di una sonda genica marcata. La differenza consiste nel fatto che i differenti campioni di acidi nucleici (DNA o RNA) non vengonoi separati per via elettroforetica ma sono depositati direttamente su filtro per poi essere ibridati con una sonda marcata. La tecnica Reverse-Blot è una modifica della Dot-Blot tradizionale: sul filtro, infatti, viene fissata la sonda non marcata che viene fatta ibridare con una soluzione d’ibridazione contenente il bersaglio precedentemente marcato.

29 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII La tecnica Reverse Dot Blot sfrutta una sonda non marcata immobilizzata su una membrana. Il DNA bersaglio è prodotto in modo tale da essere marcato con uno specifico aptene (es biotina). Quindi viene ibridato con la sonda immobilizzata e rivelato con un enzima coniugato con streptavidina e un substrato, ad esempio CL, appropriato. CL moleculeproduct immobilized gene probe streptavidin enzyme target DNAPCR biotin IBRIDAZIONE SU FILTRO

30 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII IBRIDAZIONE IN SITU Nella tecnica di ibridazione in situ, il campione è rappresentato da un tessuto o da cellule coltivate in vitro. Questi si mettono a contatto con la sonda: si procede alla denaturazione contemporanea del DNA contenuto nel tessuto e Quello della sonda e poi si lascia avvenire l’ibridazione. DNA di Papillomavirus identificato mediante una sonda genica marcata con un tracciante fluorescente DNA rivelato mediante un intercalante fluorescente Struttura cellulare rivelata mediante un anticorpo anti-citocheratina marcato con un tracciante fluorescente

31 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII La moderna biologia molecolare, sia per quanto riguarda la ricerca che le applicazioni in campo diagnostico, analitico ed industriale, non esisterebbe senza due fondamentali scoperte: enzimi utilizzati per la manipolazione delle catene di DNA (enzimi di restrizioni e ligasi) Tecniche di amplificazione del DNA basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR).

32 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Rompendo il DNA in corrispondenza del sito di restrizione, gli enzimi di restrizione possono determinare la formazione di frammenti di dsDNA con estremità “piatte” (A) o “coesive” (B): (A) (B) ENZIMI DI RESTRIZIONE

33 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII L’uso sequenziale di appropriati enzimi di restrizione e ligasi permette di tagliare ed incollare (“cut and paste”) catene di dsDNA allo scopo di isolare le sequenze geniche di interesse ed ottenere costrutti genici che le includono. DNA LIGASI

34 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII

35 L’estrema importanza in biologia molecolare della PCR è determinata da due fattori principali: - E’ possibile ottenere fattori di amplificazione (rapporto fra copie di dsDNA prodotte e sequenze dsDNA target originali) elevatissimi, anche dell’ordine di La reazione di amplificazione è specifica: una scelta adeguata di “primers” (le sequenze che inducono il processo di amplificazione) specifici per la sequenza target permette di amplificare soltanto la sequenza in esame, anche in presenza di elevate quantità di altre catene dsDNA. Alla fine dell’amplificazione, una sequenza dsDNA target presente inizialmente in poche copie costituirà la parte preponderante del DNA nel campione. REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

36 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII LIMITI DI RIVELABILITA’ DELLA PCR

37 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Il “cocktail” per la reazione PCR contiene: -l’enzima DNA polimerasi, che catalizza la crescita della sequenza complementare ad una sequenza ssDNA nella direzione 5’>3’. -un largo eccesso di due “primers” (corte sequenze di ssDNA specifiche per il legame al dsDNA target – ne occorrono due in quanto devono legarsi alle due estremità 5’ delle catene del dsDNA target). -desossiribonucleotidI trifosfati (dNTPs) -Ioni magnesio -DNA bersaglio COMPOSIZIONE DI UNA REAZIONE DI PCR

38 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII CICLO 2 SCHEMA DELLA PCR copie di dsDNA target CICLO 1 Fasi di un ciclo di PCR: Denaturazione Appaiamento (“annealing”) Estensione

39 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Denaturazione (90-95°C, 1 min) Legame dei “primers” (60°C, 1 min) Sintesi del dsDNA (70-75°C, 1 min) Denaturazione (90-95°C, 1 min) Una copia di dsDNA target cicli di amplificazione in “thermal cycler” TT copie di dsDNA target Rappresentazione schematica del processo PCR.

40 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII n plateau fase esponenziale Y L’amplificazione nella reazione a catena della polimerasi è determinata dal fatto che i prodotti di un ciclo di amplificazione possono agire come “stampi” per il ciclo successivo. Teoricamente: Y = 2 n EFFICIENZA DELL’AMPLIFICAZIONE In realtà l’amplificazione (“fase esponenziale”) non procede indefinitamente. Il numero di copie di dsDNA prodotte raggiunge un valore pressoché stazionario ”plateau” (l’aumento della quantità di prodotti di amplificazione non specifici). Un altro fattore che limita il numero di copie di dsDNA è la ridotta efficienza di amplificazione. Quindi in realtà: Y = 2 n → Y = (1 + X) n La forte dipendenza del numero di copie di dsDNA prodotte dall’efficienza è uno dei principali problemi da superare nello sviluppo di una PCR quantitativa.

41 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII La diminuzione dell’efficienza dal 100% al 95% determina una riduzione di un fattore due della quantità di amplificato! EFFICIENZA DELL’AMPLIFICAZIONE

42 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII -DNA polimerasi attive a 70-80°C ed in grado di sopravvivere alle tipiche temperature di denaturazione del DNA (90-95°C). Questi enzimi sono stati ricavata da microrganismi termofili (Thermus aquaticus, da cui il nome “Taq polymerase”) che vivono in sorgenti calde, e che sono in grado di sopravvivere a temperature vicine a 100°C. - la concentrazione dei “primers” è circa (0.1  0.5) mM - la concentrazione dDNT è (20  200) mM - la concentrazione di ioni magnesio è (0.5  2.5) mM - scelta tamponi in base al DNA target. Generalmente si usa TRIS-Cl mM con pH (8.3  9) a 25 °C. Eventuale aggiunta di detergenti non ionici (Triton X-100, Tween 20…) Thermus aquaticus Binomial name Scientific classification Thermus aquaticus Kingdom:Bacteria Phylum:Deinococcus-Thermus Class:Deinococci Order:Thermales Genus:Thermus Species:T. aquaticus VARIABILI BIOCHIMICHE DELLA PCR

43 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII VARIABILI TERMODINAMICHE DELLA PCR 1.Fase di denaturazione: una delle cause d’induccesso della PCR è l’incompleta denaturazione del DNA target e dei prodotti di reazione. 2.Fase di “annealing”: T e durata dipendono dalla concentrazione, lunghezza e composizione in basi dei “primers”. Uso di programmi computerizzati. 3.Fase di estensione: i tempi di estensione dei “primers” dipendono dalla lunghezza e dalla concentrazione delle sequenze bersaglio e dalle T di reazione. Il numero di cicli di amplificazione è un fattore importante che condizione la resa di amplificaione e dipende principalmente dalla quantità di DNA target di partenza. N° di molecole target vs. N° cicli 3* * *

44 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII FASI PREANALITICHE DELLA PCR Scelta del bersaglio. Preparazione del campione. Conservazione del campione: plasma e siero conservati a –20 °C o –80 °C; cellule conservate in azoto liquido o –70°C; Materiale conservato in formalina o paraffina. Allestimento della reazione: i cicli della PCR sono tutti uguali, tranne il primo e l’ultimo. Lo sviluppo di sistemi (“thermal cyclers”) in grado di controllare tempi e temperature di ciacuna fase ha permesso di migliorare la riproducibilità dei diversi cicli di una reazione PCR. Blocco termostatato con ricavate le sedi per i campioni da amplificare (normalmente in provette Eppendorf) con un layout tipo micropiastra (8 x 12 = 96 campioni o 16 x 24 = 384 campioni) Denaturazione Amplificazione Ibridazione dei “primers” T Ciclo di amplificazione

45 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Rivelazione del prodotto amplificato: elettroforesi,sonde geniche RIVELAZIONE DEL PRODOTTO DELLA PCR

46 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII FASI POST-PCR ed ORGANIZZAZIONE LABORATORIO PCR Controlli: verifica della specifictà e della sensibilità della reazione e dell’ eventuale presenza di falsi positivi o negativi. Organizzazione del laboratorio: Elettroforesi su gel Analisi di restrizione Tecniche d’ibridazione AREA PRE-PCRPreparazione del campione Separazione del siero Isolamento dei linfociti periferici Lisi cellulare Estrazione acido nucleico Preparazione della reazione Preparazione del tampone Preparazione aliquote dei reagenti Allestimento della reazione Rivelazione del prodotto AREA POST-PCR

47 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII PCR IN SITU La PCR in situ permette di combinare lo studio della localizzazione cellulare mediante ibridazione in situ con l’estrema sensibilità dell’amplificazione

48 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Le caratteristiche intrinseche della PCR limitano la sua applicazione quando è richiesta una accurata valutazione quantitativa della sequenza target: la quantità di prodotto ottenuto dipende infatti anche da fattori non facilmente controllabili (es. presenza di inbitori).. L’importanza applicativa di una PCR quantitativa è però talmente elevata che sono state sviluppate diverse metodologie che permettono di ridurre questi inconvenienti. PCR QUANTITATIVA

49 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Si effettua l’amplificazione su di una serie di diluizioni seriali del campione, allo scopo di individuare la massima diluizione alla quale l’amplificazione è ancora possibile. -Svantaggi: -Richiede un numero elevato di reazioni di amplificazione per ogni campione -Non tiene conto degli eventuali fattori di variazione interprovetta -Per diluizioni molto elevate la sensibilità della PCR non è sufficientemente alta PCR Fattore di diluizione limite PCR QUANTITATIVA: DILUIZIONE SCALARE

50 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Si basa sulla costruzione di una curva di calibrazione ottenuta amplificando standard a concentrazione nota di sequenza target. n Y Y [dsDNA] iniziale [dsDNA] iniziale crescente - La reazione di amplificazione deve essere interrotta nella fase esponenziale, riducendo così la quantità di amplificato ottenibile - Essendo una calibrazione esterna, non può tenere conto dell’effetto di eventuali inibitori o di altri fattori dipendenti dal particolare campione che si analizza Reazioni interrotte dopo la fase di amplificazione esponenziale n = costante PCR QUANTITATIVA: STANDARD ESTERNO

51 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII La PCR quantitativa non competitiva utilizza uno standard interno: questa tecnica prevede l’amplificazione simultanea all’interno del campione della sequenza dsDNA target e di una sequenza standard aggiunta in quantità nota, ognuna delle quali sfrutta una DIVERSA coppia di “primers”. Vantaggi: le variabili non controllabili legate alle caratteristiche del campione dovrebbero influenzare nello stesso modo le due reazioni di amplificazione. Svantaggi: poiché la reazione deve essere bloccata nella fase esponenziale, differenze nella cinetica ed efficienza di amplificazione per le diverse coppie di “primers” possono modificare il risultato dell’analisi. dsDNA standard (quantità nota) dsDNA target (quantità incognita) PCR Amplificato dello standard Amplificato del target dsDNA standard (quantità nota) dsDNA target Amplificato dello standard Amplificato del target = PCR QUANTITATIVA: PCR NON COMPETITIVA

52 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Anche la PCR quantitativa competitiva utilizza uno standard interno: in questa tecnica la sequenza dsDNA target e la sequenza standard aggiunta in quantità nota vengono amplificate utilizzando la STESSA coppia di “primers” Si costruisce una curva di calibrazione interna: quando le quantità dei due amplificati sono equivalenti, la quantità di dsDNA target iniziale coincide con quella della sequenza standard aggiunta. La misura può essere effettuata anche quando l’amplificazione ha raggiunto il “plateau”. Amplificati della sequenza target e dello standard interno separati mediante elettroforesi su gel PCR QUANTITATIVA: PCR COMPETITIVA target competitore Punto di equivalenza

53 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII L’andamento della reazione di amplificazione viene seguito in tempo reale, e quindi è possibile visualizzare l’accrescimento esponenziale dell‘amplificato permettendo l’analisi simultanea di campioni a contenuto di DNA molto differente La formazione dell’amplificato viene seguita attraverso misure di fluorescenza, attraverso l’impiego di: -Intercalanti fluorescenti del DNA, che permettono la rivelazione del dsDNA (es. SYBR® Green). -“TaqMan probes”, cioè oligonucleotidi in grado di ibridizzare con una regione interna del prodotto dell’amplificazione che portano un tracciante fluorescente in 5’ ed un “quencher” in 3’. Essi normalmente non sono fluorescenti ma quando durante la PCR viene replicata una catena ssDNA alla quale è legata una di queste molecole, l’attività 5' esonucleasica della polimerasi rompe la molecola rendendo possibile la fluorescenza. -“Molecular beacons” disegnati per ibridizzare con una regione interna del prodotto dell’amplificazione. “TaqMan probes” e “molecular beacons” permettono di effettuare PCR multiple (ad esempio è possibile amplificare anche uno standard interno) poiché sono specifici per una data sequenza amplificata (i segnali fluorescenti dei due “probes”possono essere differenziati usando due fluorofori che emettono ad una diversa lunghezza d’onda). PCR “REAL TIME”

54 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII COMPONENTI DELLA REAZIONE: 1)DNA target 2)DNA polimerasi 3)Due oligonucleotidi 4)dNTPs 5)Probe fluorescente PCR REAL TIME Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR

55 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII n Y n [dsDNA] iniziale [dsDNA] iniziale crescente L’analisi quantitativa dei risultati di una PCR “real time” può essere effettuata in vari modi. Una procedura molto usata consiste nel valutare il numero di cicli di amplificazione necessari perché il segnale dell’amplificato raggiunga un certo valore prefissato. Y = costante [dsDNA] iniziale crescente PCR QUANTITATIVA: PCR “REAL TIME”

56 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Metodi di rilevamento della fluorescenza SYBR Green TaqMan Molecular Beacons Scorpion probe

57 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII RT-PCR: 1.Isolate RNA (total or polyA) 2.Convert to cDNA (complementary DNA, using the reverse transcriptase) 3.Use the DNA as template for the PCR reaction 4.Visualize fragment on agarose gel Reverse Transcriptase PCR

58 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII i.e., your cloned gene(s) We could just 35,000 Northern to monitor expression of all genes!!! mRNAs separated on gel according to size mRNAs transferred to a membrane and hybridized with small number (1-5) of radioactively labeled DNA probes. Probe corresponds to gene of interest Target RNA is spatially fixed and the labeled probe is in solution Low throughput Northern Blot

59 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII A tale scopo negli spot del chip possono essere immobilizzate: - sequenze complementari all’mRNA associato ai geni da studiare - sequenze complementari ai cDNA ottenuti a partire dall’mRNA mediante l’enzima transcrittasi inversa. Tali sequenze possono essere ottenute per clonazione di sequenza naturali (lunghezza bp) o essere oligonucleotidi (DNA o PNA) sintetici, nel qual caso la loro lunghezza è normalmente di bp. Attualmente è possibile costruire dei chips - i vetrini su cui si posizionano gli spots di DNA - contenenti fino a sequenze DNA/cm 2 e fino a oligonucleotidi/cm 2 (gli oligonucleotidi in genere non vengono immobilizzati, ma sono prodotti direttamente sul chip). MICROARRAY A DNA

60 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICAIII Applicazioni dei microarray a DNA - Analisi dell’espressione genica. L’interesse principale della maggior parte degli studi che utilizzano i microarray consiste nel controllo dei livelli di espressione dell’RNA - Analisi della variazione della sequenza del DNA. Si utilizzano microarray di oligonucleotidi in grado di appaiarsi con tutte le sequenze wildtype e con le sequenze dove ci siano sostituzioni di un unico nucleotide. La forza dell’ibridazione è proporzionale al numero di appaiamenti corretti e massima quando un oligonucleotide è complementare ad una delle sequenze del DNA da analizzare. Questa tecnica è stata utilizzata per l’analisi di mutazioni di geni-malattia noti (es. gene BRCA1 per la suscettibilità al carcinoma della mammella) e per lo studio di marcatori per polimorfismi di un solo nucleotide (SNP, “single nucleotide polymorphism”). Applied Biosystems Human Genome Survey Microarray V2.0 The Applied Biosystems Human Genome Survey Microarray V2.0 contains 32,878 probes for the interrogation of 29,098 genes, making it the most informative and comprehensive genomic coverage of any microarray platform. Access the most comprehensive human genome set available, with probe designs for 2,180 more genes than any other microarray platform. Interrogate more than 8,000 genes not covered by other commercial microarrays. MICROARRAY A DNA


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