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Ruolo degli Agenti Demetilanti in Ematologia. Metilazione del DNA e Repressione della Trascrizione Trascrizione attiva Repressione POLII C CC TF C C C.

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1 Ruolo degli Agenti Demetilanti in Ematologia

2 Metilazione del DNA e Repressione della Trascrizione Trascrizione attiva Repressione POLII C CC TF C C C X CH 3 X MeCP DNA-non metilatoDNA metilato

3 Le CpG islands : 200 bp-5000 bp. Si trovano principalmente nei promotori dei geni e negli introni. Sono normalmente non-metilate nei geni house-keeping Sono metilate nei geni tessuto-specifici. La demetilazione determina il differenziamento cellulare (es: geni del differenziamento mieloide, HbF) Metilazione nel genoma umano Herman et al, NEJM, 2003

4 MBP Rimodell HDAC DNMT Silenziamento trascrizionale epigenetico DNMT1, 3a, 3b Istone metilasi Silenziamento genico TF C C C X CH 3 X Ipermetilazione siRNA

5 L ipermetilazione globale e frequente nelle LMA Costello et al, Nature Genetics, 2000

6 Ipermetilazione di geni oncosoppressori L ipermetilazione contribuisce alla trasformazione e alla progressione neoplastica mediante l inattivazione di geni oncosoppressori L ipermetilazione di diversi geni si trova gia nelle lesioni pre- cancerose del colon, indicando il possibile ruolo dellipermetilazione durante la iniziazione della tumorigenesi. Elevata frequenza di ipermetilazione anche nelle MDS. Analogamente al colon, le MDS rappresentano spesso la fase pre- neoplastica delle AML Il 68% delle t-MDS/t-AML presenta ipermetilazione di p15, che correla con la presenza di 7q-, allo stadio della t-MDS, e alla percentuale di blasti midollari (Christiansen, Leukemia 2003).

7 Crescita autonoma The Hallmarks of Cancer Blocco dell Apoptosi Ridotta sensibilita ai segnali inibitori della proliferazione Angiogenesi Replicazione Incontrollata Angioinvasivita e Metastasi U M Cancro

8 FunzioneGeneMieloideLinfoide Ciclo cellulare p15, p16 (Inib-Kinasi- CD) MDS, AML, CML ALL, NHL, MM Trasduzione segnale RAR AMLALL, NHL, MM Estrogen receptor AML, CMLALL, NHL, MM Apoptosi P73 (p53-like) transcr.factor ALL, NHL, MM DAP-kinasiAML-MDSALL, NHL, MM Contatto cell. Metastasi E-Caderina (Ca++/adesion e cell.) CML (Cadherin- 13), AML ALL, NHL (Cadherin-13), MM Geni ipermetilati in Ematologia

9 Meccanismi di ipermetilazione nelle LMA Diretto: Iperespressione di DNMT1, 3a, 3b Mizuno et al, Blood 2001

10 Nella APL PML/RAR lega DNMT3a e interferisce con HDAC,bloccando lespressione di geni RAR-dependent (Di Croce et al, Science 2002) Meccanismi di ipermetilazione nelle LMA Indiretti AML1/Eto lega HDAC e reprime la trascrizione (Amman et al, MCB 2001)

11 Geni importanti per la leucemogenesi, regolati dalla metilazione del promotore BRCA-1: e un gene di riparazione/ricombinazione del DNA, importante nel mantenimento dellintegrita genomica. E metilato nel 65% dei tumori ovarici e nel 10% di quelli mammari non-ereditari. GSTP1: e un gene di detossificazione. DAP-chinasi: è una serin/treonina chinasi, regolata da calcio e calmodulina, con una funzione pro-apoptotica. MGMT(O 6 -metilguanina-metiltransferasi): è un gene di riparazione del DNA che rimuove agenti alchilanti e citotossici dalla posizione 0 6 della guanina.

12 Methylation-Specific PCR (MSP) 100 bp DNA Ladder Unmethylated Methylated

13 Frequenza di ipermetilazione nelle LMA (n=150) DAP- KINASI MGMTBRCA-1GSTP1 Unmethylated Methylated

14 BRCA-1 p= 0.06 GSTP-1 p= 0.2 DAP-K p= 0.01 OR 2.8 ( ) MGMT P= 0.04 OR 5 (1.2-22) Therapy-related De novo Therapy-related De novo 13/17 50/100 7/25 18/111 15/30 40/154 4/25 4/111 Ipermetilazionee leucemietherapy-related

15 Ipermetilazione e Prognosi Overall Survival T-MDS Christiansen et al, Leukemia 2003

16 Roman-Gomez-J, n=251 pts, Blood 2004 Leucemia linfoblastica acuta

17 DFS OS Roman-Gomez-J, n=251 pts, Blood 2004 ALL

18 MGMT e Prognosi: 84 pts con B-DLCL Esteller et al, JNCI 2001

19 Agenti demetilanti Trascrizione attiva TF C C C CH 3 Demetilanti: Azacitidina, Decitabina, Pseudoisocitidina, 5-Fluorodeoxicitidina,Zebularina, Procainamide (?) Inibitori dell Istone Deacetilasi: Acido Valproico, sodio-fenil-butirato, Tricostatina,Depsipeptide DNMT1, 3a, 3b MBP Rimodell HDAC DNMT

20 Meccanismo di azione dellAzacitidina Herman et al, NEJM, 2003

21 t=01234 Tc Aza 0,5μM Aza 1μM Days of culture Treatment of Jurkat cell line Cells (10 6 /ml) Azacitidina Decitabina 10 Ac.Ac Dec 1μM Tc Ac.Ac

22 5 aza-2-deoxicytidine Treatment Raji cell line Demethylation MSP DAP-Kinasi J- 200 nM DAC1 μM DAC mock days Unmethylated reaction Methylated reaction

23 DAP-KINASE 5 aza-2deoxicytidine Treatment Raji cell line Expression GAPDH M days 200 nM DAC 1 μM DAC mock

24 Demethylation of DAP-KINASE and Apoptosis (HL-60 cells) Day 0 14 Tc Aza 1μM Ac.Ac 4.5% Day 0 2.3% Ac.Ac 14% Aza Day 4 %

25 5-azacytidine Treatment N= 191 pz with MDS 75 mg/m 2 per 7 gg, ogni 28 gg Silverman et al, JCO 2002 N=37 pz no CR/PR At 4 months: Aza 60% response CR 7% PR 16% Improved 37% Supp. Care 5% improved

26 Silverman et al, JCO 2002 Time to AML transformation or Death N=191 MDS pz OS in relazione allIPSS Leucopenia grado 3-4: 59% Neutropenia: 81% Trombocitopenia 70% Infezioni 20% Nausea e vomito 4% Median Time to Progression Aza : 21 mesi Supp. Care: 12 mesi

27 Van den Bosch et al, Leukemia 2004 Decitabine Treatment N=162 pz IPSS>Intermedio 1 PLTs stabili PLTs dopo 1 ciclo PLTs

28 Decitabine – Escalating doses N=48, 35 AML, 7 MDS, 5 CML, 1 ALL Issa et al, Blood 2004 Non-hematological side-effects

29 Decitabine – Bu/Cy for BMT (N = 43 pz) Overall Survival Decitabine 400 mg/m Days -10 e -11 De Lima et al, Cancer 2003

30 Rischi della demetilazione Attivazione di proto-oncogeni Instabilita cromosomica Mutazioni Topi con ridotta DNMT1 presentano ipometilazione diffusa con ridotta stabilita genomica e presentano unelevata incidenza di linfomi T (Gaudet et al, Science 2003) La sindrome ICF (immunodeficit, instabilita dei centromeri e anomalie faciali) e dovuta a una mutazione della DNMT3B e si caratterizza per una diffusa ipometilazione del DNA satellite. Incidenza di tumori non aumentata. La demetilazione farmacologica e transiente e reversibile entro 2 settimane (Yang AS, Science 2003)


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