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Frequenza di occorrenza del tetrapeptide HGGG e sue possibili implicazioni biologiche Relatore Prof.ssa Silvia Morante Candidato Stefania Alleva Anno Accademico.

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1 Frequenza di occorrenza del tetrapeptide HGGG e sue possibili implicazioni biologiche Relatore Prof.ssa Silvia Morante Candidato Stefania Alleva Anno Accademico 2005/2006 Tesi di Laurea Triennale in Fisica Università degli studi di Roma Tor Vergata Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

2 SOMMARIO Introduzione: le malattie neurodegenerative; La Proteina Prionica: i motivi ripetuti e il legame con il Cu +2 ; Tecniche utilizzate per studiare il sito di legame PrP- Cu +2 : Diffrazione a raggi X; Spettroscopia XAS; Spettroscopia EPR; Simulazioni numeriche; Analisi statistica sulla frequenza di occorrenza del tetrapeptide HGGG: verifica della rarità; Ricerca di omologie, affinità, relazioni tra le proteine umane dotate del peptide studiando: struttura primaria, struttura secondaria, struttura terziaria, idropaticità, sito di legame per i metalli; Conclusioni e sviluppi futuri.

3 MALATTIE NEURODEGENERATIVE Agente infettivo: PROTEINA MALATTIE NEURODEGENERATIVE Morbo di Parkinson Morbo di Alzheimer Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE) CJD nvCJD MISFOLDING AGGREGAZIONE

4 LA PROTEINA PRIONICA (PrP c ) Glicoproteina di membrana (cellule presinaptiche) Numero di a.a. variabile da specie a specie Dominio globulare (strutturato e intramembrana) e dominio non strutturato extramembrana nella regione N-terminale Presenza nel dominio N-terminale di vari octarepeats (PHGGGWGQ), potenziali siti di legame per il Cu +2 Funzione esatta ignota IPOTESI PIU ACCREDITATE 1.Traduzione di segnali cellulari 2.Adesione molecolare 3.Trasporto e chelazione del rame 4.Antiossidante LA PROTEINA PRIONICA SCRAPIE (PrP sc ) L agente patogeno della TSE è la PrP sc, forma anomala della PrP c, in cui tratti di α elica sono sostituiti da β-sheet all estremità C-terminale M isfolding probabilmente legato all interazione con Cu +2 L a PrP sc si accumula nel CNS portando, dopo anni, alla rottura della barriera ematoencefalica M odello diffusione intracellulare cerebrale domino-stone C ontagio avviene in genere per progressivo misfolding e aggregazione di PrP adiacenti ma la malattia può essere trasmessa per iniezione di PrP sc intraoculare, intravenosa e intracerebrale. La PrP sc raggiunge, trasportata dalle cellule B, le terminazioni nervose senza danneggiare organi e tessuti attraversati DETERMINARE LA COORDINAZIONE OCTAREPEAT-Cu +2 Diffrazione a raggi X Spettroscopia XAS Spettroscopia EPR Simulazioni numeriche

5 DIFFRAZIONE A RAGGI X Permette di determinare la disposizione degli atomi in strutture ordinate (cristalli) Un fascio di fotoni (raggi X) è inviato sul campione Le nubi elettroniche degli atomi diffrangono tali onde che interferiscono Dai pattern di diffrazione si elaborano modelli strutturali del sistema analizzato Confronto pattern di diffrazione simulati e sperimentali

6 STRUTTURA CRISTALLOGRAFICA AI RAGGI X DEL COMPLESSO HGGGW-Cu +2 Legame peculiare HGGGW/Cu +2 N ε dellH 1 N deprotonati di G 2 e G 3 O di G 3 O di una molecola H 2 O La catena laterale del W è parallela al piano equatoriale Probabilmente tiene in sito lH 2 O Il metallo è legato alla catena principale Burns C.S., Aronoff-Spencer E., Dunham C.M., Lario P., Avdievich N.I., Antholine W.E., Olmsteam M.M., Vrielink A., Gerfen G.J., Peisach J., Scott W.G., Millhauser G.L.. Biochemistry

7 SPETTROSCOPIA XAS (X-ray Absorption Spectroscopy) Legge di Lambert-Beer C ampione in qualsiasi stato di aggregazione; N on esistono regole di selezione; A cquisizione rapida dello spettro. Vantaggi

8 SPETTRO XAS Energia di soglia Energia di ionizzazione elettrone interno Molteplici per ogni specie atomica Distinguibili per atomi con Z diversi ed elevati ATOMO ISOLATOSISTEMA MULTIATOMICO K-edge =>1s

9 Spettro XAS analizzato in termini della quantità χ(k) k è il vettore donda del fotoelettrone emesso Per energie sufficientemente elevate è adottabile lapprossimazione di singolo scattering (regione EXAFS)

10 Fase e ampiezza onde di back scattering sono caratteristiche per ogni specie atomica. Ma per atomi leggeri (C, O, N) NON sono DISTINGUIBLI È necessario introdurre i termini di scattering multiplo per distinguere i vari a.a. (regione XANES) χ(k) è approssimato da una sommatorie di un numero finito di termini irriducibili

11 DATI XAS IN COMPOSTI OCTAREPEATS-Cu +2 Morante S., González-Iglesias R., Potrich C., Meneghini C., Meyer-Klaucke W., Minestrina G., Gasset M. (2004). J. Biol. Chem.. Dati XAS alla soglia K del Cu +2 in composti con numero vario di octarepeats e diversi rapporti di concentrazione peptide /Cu +2 (R) Sequenza peptidi utilizzatiNumero sitiR legame Cu +2 KKRPKPWGQPHGGGWGQ10,5 KKRPKPWGQ(PHGGGWGQ) 2 21,5 KKRPKPWGQ(PHGGGWGQ) 4 42 BoPrP-(24-242)63 REGIONE XANES Stesso stato di ossidazione REGIONE EXAFS Si osservano delle differenze GEOMETRIA INTRA-REPEAT (1 o 2 octarepeats) GEOMETRIA INTER-REPEAT (4 o 6 octarepeats)

12 GEOMETRIA DI COORDINAZIONE INTRA-REPEAT Il fit è compatibile con una struttura identica a quella cristallografica in cui il legame è completamente nel singolo octarepeat Ciascun atomo di rame è legato a tre atomi di azoto e uno di ossigeno posti su un piano Il fit è compatibile con la presenza di un atomo di ossigeno a distanza maggiore e su un piano ortogonale GEOMETRIA DI COORDINAZIONE INTER-REPEAT Il Cu +2 è legato agli anelli imidazolici di due His di octarepeats diversi NB: Se la concentrazione di Cu +2 non satura tutti gli octarepeats Il legame avviene tra diversi octarepeats Se appartengono a diverse PrP potrebbe favorire laggregazione

13 SPETTROSCOPIA EPR (Electron Paramagnetic Resonance) Basata sullassorbimento di energia da parte di un sistema dotato di un elettrone spaiato immerso in un campo magnetico statico (H) LHamiltoniana del sistema H=H e +H iperfine = βS·g·H + S·A·I Interazione col campo magnetico Interazione iperfine Campo magnetico efficace Rapporto giromagnetico considera lo splitting Zeeman Energia di contatto di Fermi Termine dipolare ATOMO DI IDROGENO Sono permesse (per lidrogeno S=1/2 e I=1/2) solo le transizioni

14 Risultati Cu +2 lega preferibilmente loctarepeat La geometria di coordinazione dipende dalla concentrazione relativa peptide/Cu +2 Diverso ruolo delle His e delle Gly nel legare il metallo Sono stati simulati spettri EPR implementando la precedente Hamiltoniana in sistemi contenenti uno o due ioni Cu +2, in approssimazione di geometria rigida e usando sequenze peptidiche diverse per numero di octarepeats e composizione in a.a. SIMULAZIONI EPR IN COMPOSTO OCTAREPEAT-Cu +2 Chattopadhyay, M.; Walter, E. D.; Newell, D. J.; Jackson, P. J.; Aronoff-Spencer, E.; Peisach, J.; Gerfen, G. J.; Bennett, B.; Antholine, W. E.; Millhauser, G. L. (2005). J. Am. Chem. Soc.

15 Componenti dello spettro EPR COMPONENTE 1 Cu +2 satura tutti gli octarepeats Stessa struttura della cristallografia COMPONENTE 2 Concentrazione intermedia Cu +2 Riduzione distanza tra atomi Cu +2 si lega a N ε e N dellHis e agli O di due H 2 O Stabilizzato da più octarepeats COMPONENTE 3 Bassa concentrazione Cu +2 Un singolo Cu +2 è legato a tre N ε delle His Peptidi con 3 o 4 octarepeats Lo spettro mostra tutte le componenti ma la forma varia con la concentrazione

16 SEQUENZE UTILIZZATE E COMPONENTI DELLO SPETTRO EPR SEQUENZA PEPTIDICA COMP N. 1 COMP N. 2 COMP N. 3 KKRPKPWGQ(PHGGGWGQ) 4 XXX (PHGGGWGQ) 3 XXX HGGGWGQPHGGGW XX PHGGGWGQ X HGGGW X KKRPKPWGQ(PHGXGWGQ) 4 XX HGXGWGQPHGXGW X HGXGW X HXGGW X HGGGWGQPYGGGW X YGGGWGQPHGGGW X HGGGWGQPYGGGWGQPHGG GW X La sostituzione di una G con X comporta una modifica del sito di legame HGGGWGQPYGGGWX YGGGWGQPHGGGWX HGGGWGQPYGGGWGQPHGG GWX Sostituendo lHis con Tyr cambia il sito di legame KKRPKPWGQ(PHGXGWGQ) 4 XX HGXGWGQPHGXGW X HGXGW X HXGGW X

17 SIMULAZIONI NUMERICHE Simulazioni di dinamica molecolare del tipo Car-Parrinello per studiare la coordinazione del Cu +2 RISULTATI Il legame tra il Cu +2 e gli azoti deprotonati delle G 2 e G 3 è estremamente stabile La presenza del triptofano W 5 sembra non avere influenza sulla stabilità del legame Usando dipeptidi [Cu(HGGG)] 2 è stata messa in evidenza una struttura entangled I due ioni nei diversi peptidi si scambiano dinamicamente i leganti Furlan S., Guerrieri F., La Penna G., Morante S., Rossi G.C. Journal of Biological Inorganic Chemistry; European Biophysics Journal

18 FREQUENZA DEL TETRAPEPTIDE TRA LE SEQUENZE UMANE IPOTESI IPOTESI: HGGG nocivo in tutte le proteine TESI TESI: La selezione naturale ha eliminato il motivo dalle sequenze proteiche HGGG frequenza significativamente minore dellaspettato Analisi statistica usando lalgoritmo delle parole rare Una sequenza oligopeptidica (r) in una sequenza proteica è detta parola (b 1 b 2 …b r ) BIAS: parole rare in parole più lunghe: si ipotizza un processo Markoviano di ordine (r-2) Sfruttando iterativamente il teorema della probabilità condizionata Identificando la probabilità con la frequenza di occorrenza Colosimo A., Morante S, Parisi V. and Rossi G. C. J. theor. Biol.

19 Frequenza sperimentaleFrequenza teorica attesa Questi valori vanno confrontati D>>1; D<<1 parola significativamente abbondante o rara a opera della selezione naturale D 1 parola compare con frequenza non significativamente diversa dal valore teorico aspettato si introduce la variabile

20 MISURA DI T 4 (HGXY) e E 4 (HGXY) Algoritmo delle parole rare utilizzato per determinare la frequenza delle quadruplette HGXY Programma cicle.pl legge tutte le sequenze proteiche umane depositate e misura, restituendoli in output, il numero di volte e in quante proteine compaiono i peptidi HGX, GXY, GX e HGXY Programma ratio.pl, dopo aver calcolato i valori delle variabili E r (b 1 b 2 …b r ) per ogni parola scelta e quello di T 4 (HGXY), calcola D 4 (HGXY) e lo restituisce in output Risultati D 4 (HGGG)0,75 HGGG risulta raro 63 peptidi hanno D 4 (HGXY)

21 CORREZIONI SUL CAMPIONE eliminare dal campione le sequenze ipotetiche controllare gli aggiornamenti delle informazioni depositate in banca dati eliminare le ripetizioni controllare i siti di taglio Campione iniziale costituito da 157 proteine umane contenenti il peptide HGGG e identificate con codici diversi ALLINEAMENTO MULTIPLO(ClustalW) Raggruppato proteine con definizione simile Allineate con gap open penality massima, gap extension penality minima e matrice di identità Se le sequenze erano allineate e le funzioni molecolari identiche una sola proteina è stata considerata Campione finale costituito da 99 proteine umane diverse e contenenti il peptide HGGG CORREZIONI

22 RICERCA DI OMOLOGIE Se HGGG ha un ruolo simile in tutte le proteine in cui si trova Potrebbe trovarsi in una regione scarsamente interagente con lambiente circostante Esiste il PDB SOLO di unaltra proteina oltre la PrP PrP oltre a legare Cu +2 è una proteina di membrana Classificato le proteine Proteine che legano metalli Proteine di membrana Funzione esatta PrP ignota Ricercato funzione molecolare svolta e processo biologico in cui interviene per ogni proteina Analisi struttura primaria Informazioni sugli altri livelli strutturali Lunghezza proteine Localizzazione peptide Profili idropaticità Struttura secondariaIl peptide è in una regione di random-coil nella PrP

23 PROTEINE CHE LEGANO METALLI 20 proteine legano metalli 15 Zn 3 Cu 1 Fe 1 Zn-Fe-Co-Mn Ricerca del sito di legame Solo di 10 proteine che legano Zn In due zinc-finger protein lHGGG è parte dello zinc- finger domain (C2H2) Zinc-finger domain Dominio costituito da a.a. che lega Zn Presente in molte proteine Esistono vari classi Più comune (C2H2) Zinc-finger protein Sono dotate dello zinc-finger domain Proprietà specifiche (legano DNA con il dominio) Allineamento multiplo PrP con altre leganti Cu +2 PrP con le tre zinc-finger protein dellelenco (lett.) PrP con le due zinc-finger protein precedenti PrP con ognuna delle due zinc-finger protein precedenti ClustalW con opportuni punteggi di penalità e varie matrici di simiglianza Nessun risultato soddisfacente BUON ALLINEAMENTO

24 ALLINEAMENTO PrP-Zinc Finger Protein HGGG compare due volte nella zinc finger protein

25 PROTEINE DI MEMBRANA 27 proteine di membrana 4 legano metalli 3 Cu 1 Fe Stimato le regioni transmembrana PrP ha il dominio N-terminale (comprende HGGG)nella regione non citosolica, il dominio C- terminale allinterno della cellula e due regioni transmembrana TMHMM2 RISULTATI HGGG non è mai in una regione transmembrana In 3 casi lHGGG è nella regione citosolica In 24 casi lHGGG è nella regione non citosolica In 13 casi le proteine non hanno regioni transmembrana Verifica validità del programma con dati noti della PrP

26 PROCESSO BIOLOGICOABC Metabolismo2364 Regolazione Metabolismo Acidi Nucleici2309 Comunicazione Cellulare E Trasduzione Dei Segnali1491 Crescita & Mantenimento Cellulare1152 Risposta Immunitaria110 Trasporto441 Apoptosi100 Sconosciuto2023 PROCESSO BIOLOGICO La maggior parte delle proteine prende parte a processi metabolici (13 C) FUNZIONE MOLECOLARE ABC Enzima2166 Regolatore912 Recettore550 Strutturali931 Ligandi743 Trasporto551 Chaperone100 Fattori Di Trascrizione1102 Sconosciuta2935 Recenti studi sostengono che la PrP potrebbe essere un fattore di trascrizione Lallineamento non ha mostrato risultati interessanti

27 LUNGHEZZA PROTEINE Lunghezza di una proteina Struttura e funzioni svolte Confrontare il nostro campione con tutte le sequenze proteiche depositate in banca dati Sequenze banca dati Sequenze nostro campione Numero diverso di proteine con cui è stata realizzata la distribuzione; Banca dati non solo sequenze proteiche umane Picco della distribuzione è a lunghezza maggiore nel nostro campione

28 SEQUENZE SEGNALE & LOCALIZZAZIONE DEL PEPTIDE SIGNAL PEPTIDE = breve sequenza (3-60 a.a.) utilizzata per il trasporto della proteina Regione Iniziale (N-terminale) primi 60 a.a. Regione Finale (C-terminale) ultimi 60 a.a. HGGG nella regione N-terminale 21 HGGG nella regione C-terminale 9 HGGG tende preferibilmente a trovarsi in una regione centrale della sequenza (69/99) Nella PrP i primi due octarepeats sono nella regione iniziale

29 PROFILI DI IDROPATICITA IDROPATICITA Misura del ΔG di trasferimento di un soluto da un solvente apolare a uno polare ΔG =ΔH-T ΔS Misura la propensità di un a.a. a collocarsi in una regione polare (ΔG 0 a.a. idrofobico) Si realizzano delle scale di idropaticità in base ai valori di ΔG Sequenza => stringa di numeri Profili di idropaticità Profilo della PrP Realizzato con ProtScale LHP del singolo a.a. è mediata sui primi vicini Valore di riferimento -0,4 (HP Gly)

30 RISULTATI Tutte le proteine sono caratterizzate da zone anfifiliche La maggior parte delle proteine che legano metalli sono anfifiliche Proteine sono di membrana sono prevalentemente anfifiliche ANALISI DELLA REGIONE ATTORNO IL TETRAPEPTIDE Nella metà dei casi il peptide è in una regione anfifilica Nel 40% dei casi è in una regione idrofilica In 7 peptidi è localizzato in una regione idrofobica Nella PrP e nelle due zinc-finger protein in cui lH partecipa al sito di legame il peptide è in una regione idrofilica compresa tra due regione idrofobiche

31 STRUTTURA SECONDARIA α ELICAβ sheetRandom-coil Ciascun a.a. ha una propensità a trovarsi in una struttura Predire la struttura secondaria HNN (corrispondenza con la realtà superiore al 60%) Abbiamo rilevato che: Il peptide HGGG si colloca preferibilmente in una regione di random coil Solo in 6 proteine lHis è in una regione strutturata ; La maggior parte delle proteine ha una struttura prevalentemente random-coil STRUTTURA SECONDARIA > 50%random coil >random coil elica=random coil > elica>50% elica

32 CONCLUSIONI & FUTURI SVILUPPI Il motivo HGGG è risultato significativamente raro nelle sequenze proteiche umane depositate Non è stata individuata una caratteristica comune alle proteine che lo contengono che possa chiaramente indicare le ragioni della rarità Ripetizione dellintera procedura di analisi sul peptide GGGH Utilizzare simulazioni numeriche ed esperimenti in vitro per misurare laffinità per il Cu +2 delle proteine del campione simili alla PrP Raffinamento delle tecniche di allineamento con luso di altre matrici di proprietà Raffinamento dellanalisi dei profili di idropaticità Verifica del dato relativo alla quasi totale assenza nel campione (2/100 contro un valore medio di 40/100) di proteine di cui è nota la struttura


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