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L. 499/99 - PROGRAMMI INTERREGIONALI PROGRAMMA "SVILUPPO RURALE" SOTTOPROGRAMMA "INNOVAZIONE E RICERCA" D.M. n. 25279 del 23/12/03 Qualificazione del Vivaismo.

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1 L. 499/99 - PROGRAMMI INTERREGIONALI PROGRAMMA "SVILUPPO RURALE" SOTTOPROGRAMMA "INNOVAZIONE E RICERCA" D.M. n del 23/12/03 Qualificazione del Vivaismo Olivicolo: Caratterizzazione Varietale, Sanitaria e Innovazioni Nella Tecnica Vivaistica (OLVIVA) DIAGNOSI DI AGENTI PATOGENI TRASMESSI MEDIANTE IL MATERIALE DI PROPAGAZIONE Dr.ssa Loconsole Giuliana (DPPMA) - Università degli Studi di Bari Tematica 2 : Diagnosi fitopatologica e risanamento Attività 2.1 Accertamenti virologici Attività 2.3 Diagnosi di patogeni fungini in vivaio Responsabile Dott. ssa Saponari Maria (CRSA)

2 materiale vegetale dolivo deve soddisfare i requisiti sanitari e genetici imposti dalle direttive CEE sulle condizioni minime per la commercializzazione dei materiali di moltiplicazione. (Conformitas Agraria Communitatis -CAC, Dir. n. 92/34 del 28 aprile 1992, e Dir. n. 93/48 del 23 giugno 1993 recepite con decreto ministeriale 14/04/1997) DM 16/06/1993 (Virus esente e/o virus controllato) In Italia sistema di certificazione volontaria che assicura garanzie di tipo fitosanitario e di corrispondenza varietale e la tracciabilità di tutta la produzione nazionale. Utilizzo di materiale di propagazione certificato

3 Aspetto fondamentale Disponibilità di strumenti diagnostici in grado di identificare gli agenti patogeni in maniera inequivocabile nei materiali di propagazione in ogni fase della filiera vivaistica Produzione e utilizzo di materiale di propagazione certificato

4 ATTIVITA 2.1 Accertamenti virologici fino ad oggi identificati 14 agenti virali dellolivo Nepovirus Tobamovirus Cucumovirus Necrovirus Nepovirus Oleavirus Potexvirus Undetermined Closterovirus Necrovirus 1. Strawberry latent ringspot virus 2. Arabis mosaic virus 3. Cherry leafroll virus 4. Tobacco mosaic virus 5. Cucumber mosaic virus 6. Tobacco necrosis virus 7. Olive latent virus 1 8. Olive latent ringspot virus 9. Olive latent virus Olive vein yellowing associated virus 11. Olive yellow mottling and decline- associated virus 12. Olive semilatent virus 13. Olive leaf yellowing-associated virus 14. Olive mild mosaic virus Specie (SLRV) (ArMV) (CLRV) (TMV) (CMV) (TNV) (OLV-1) (OLRSV) (OLV-2) (OVYaV) (OMYDaV) (OSLV) (OLYaV) (OMMV) Genere Stato dellarte

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6 ATTIVITA 2.1 Accertamenti virologici – Stato dellarte Materiale CAC Esenza da tutti virus VF DM 14/4/97 - D.M. 4/05/ Disciplinare di produzione del materiale di propagazione di olivo ArMV CLRV SLRV CMV OLV-1 OLV-2 OLYaV TNV VT ArMV CLRV SLRV OLV-1 OLYaV

7 ATTIVITA 2.1 Accertamenti virologici – Stato dellarte Attualmente metodologie diagnostiche molecolari 1)IBRIDAZIONE MOLECOLARE CON RIBOSONDE VIRUS SPECIFICHE (Grieco et al., 2000; Saponari et al.,2001) 4) Analisi del dsRNA 2) RT-PCR con primers virus-specifici (Grieco et al., 2000) 3) ONE-STEP RT-PCR con primers virus-specifici (Faggioli et al., 2005 ) determinazione della virus esenza

8 ATTIVITA 2.1 Accertamenti virologici – Stato dellarte A seguito dell applicazione di tali tecniche di diagnosi, l olivo si è rivelato negli ultimi anni ospite di molti agenti virali, che conseguentemente hanno reso indispensabile, anche per questa specie, numerosi programmi di accertamento sanitario mediante saggi di laboratorio

9 OBIETTIVO - DIAGNOSI FITOPATOLOGICA (Tem.2) INDIVIDUAZIONE DI MATERIALE SANITARIAMENTE MIGLIORATO per la produzione di Fonti Primarie di Cloni e Varietà di interesse per le aree oggetto dellintervento mediante VERIFICA DELLO STATO SANITARIO con TECNICHE DI DIAGNOSI INNOVATIVE E VALIDATE per lidentificazione univoca dei principali agenti virali contemplati dalle normative di certificazione ATTIVITA 2.1 Accertamenti virologici

10 2.1 Accertamenti virologici Attività previste e metodologie impiegate Valutazione dello stato sanitario del materiale oggetto di caratterizzazione varietale, verifica assenza dei principali agenti virali contemplati dalle normative per la certificazione (I e II anno) 1. Scelta dei genotipi da sottoporre ad accertamenti fitosanitari 20 genotipi per ciascuna varietà oggetto delle attività di caratterizzazione varietale

11 2.1 Accertamenti virologici – Attività previste e metodologie impiegate 2. Raccolta dei campioni e distribuzione nei laboratori Rami, talee (campioni distribuiti a tutti i laboratori per ring-tests) 3. Analisi di laboratorio Dot blot hybridization su TNA, estratti con microcromatografia su particelle di silica, mediante ribosonde marcate con digossigenina (Saponari et al., 2001) per diagnosi simultanea di ArMV SLRV CLRV OLV-1

12 2.1 Accertamenti virologici – Attività previste e metodologie impiegate RT-PCR con primers virus- specifici (Grieco et al., 2000) per OLYaV Estrazione ed analisi elettroforetica dei dsRNA (virus-esenza) ONE-STEP RT-PCR con primers virus-specifici (Faggioli et al., 2005) per ArMV, SLRV, CLRV, OLV-1, OLYaV

13 6. Comparazione risultati e definizione protocollo comune (diagnosi multipla) 4. Messa a punto di tecniche rapide ed affidabili, come valida alternativa al dsRNA lungo e laborioso, che richiedano quantità minime di campione. 2.1 Accertamenti virologici – Attività previste e metodologie impiegate 5. Messa a punto di un protocollo di diagnosi multipla di tutti i virus riscontrabili in olivo risparmio tempi e costi.

14 7. Accertamenti sanitari mirati sul materiale (II e III anno) ambientato, termotrattato e rigenerato in vitro 2.1 Accertamenti virologici – Attività previste e metodologie impiegate 8. Moltiplicazione per innesto o autoradicazione (III anno), in condizione controllate, del materiale che risulterà rispondente ai requisiti fitosanitari imposti dalle normative di certificazione

15 ATTIVITA 2.3 Diagnosi di patogeni fungini in vivaio Stato dellarte Verticillium dahliae D.M. 14/07/1997 D.M. 16/06/1993 La verticilliosi è la malattia fungina più importante dellolivo e risulta grave soprattutto negli impianti giovani.

16 La malattia mostra un aumento della diffusione in tutti i paesi del bacino del Mediterraneo, soprattutto negli impianti giovani ed intensivi, probabilmente a causa dellimpiego di materiale di propagazione infetto e dellimpianto in terreni contaminati dal patogeno (Jimenz-Diaz et al., 1998; Nigro et al., 2005).

17 Considerata linefficacia dei mezzi chimici tradizionali nella lotta contro la malattia, gli accertamenti fitosanitari sul materiale di propagazione e sui terreni oggetto dei nuovi impianti costituiscono un importante strumento di difesa. ATTIVITA 2.3 Diagnosi patogeni fungini in vivaio – Stato dellarte

18 Strategie nella lotta contro Vertillium dahliae ATTIVITA 2.3 Diagnosi patogeni fungini in vivaio – Stato dellarte monitoraggio dei propaguli nel terreno impiego di materiale di propagazione sano Tecniche di diagnosi tradizionali isolamento del patogeno da porzioni di legno su substrato agarizzato determinazione della densità di inoculo dei microsclerozi nel terreno mediante substrato semiselettivo

19 Tecniche di diagnosi molecolare DPPMA messa a punto di un protocollo di Real time Scorpion-PCR per V. dahliae (Nigro et al., 2001, 2002, 2004) Alternativa ai metodi tradizionali per identificare il patogeno sia nel terreno che nel legno di piante infette ATTIVITA 2.3 Diagnosi patogeni fungini in vivaio – Stato dellarte il trasferimento di tale tecnica ai laboratori accreditati necessita di una validazione su larga scala (affidabilità e validità)

20 ATTIVITA 2.3 Diagnosi patogeni fungini in vivaio – Stato dellarte Marciume radicale da Phytophtora spp. indagini in Puglia, sia in vivaio sia in giovani impianti intensivi di olivo, hanno indicato la diffusa presenza di diverse specie di Phytophthora nel terreno alcune delle quali associate a gravi casi di marciume radicale. Alcune di queste sono state identificate come P. palmivora P. citricola e P. megasperma (Nigro e Ippolito, dati non pubblicati); tuttavia, P. palmivora è la specie più frequente. nel mediterraneo ed in Italia meridionale osservati casi di disseccamenti e morte di giovani piante di olivo causati da diverse specie di Phytophthora (Magnano di San Lio et al. 1999; Sanchez Hernandez et al., 2001).

21 Strategie nella lotta contro Phytophtora spp. capillare monitoraggio dei propaguli del patogeno nel terreno e sulle radichette in vivaio corretta identificazione delle specie coinvolte impiego di materiale di propagazione sano ATTIVITA 2.3 Diagnosi patogeni fungini in vivaio – Stato dellarte

22 Propaguli di Phytophthora spp. isolati da terreno su substrato selettivo. ATTIVITA 2.3 Diagnosi patogeni fungini in vivaio – Stato dellarte Tecniche di diagnosi tradizionali

23 Diagnosi molecolare ATTIVITA 2.3 Diagnosi patogeni fungini in vivaio – Stato dellarte Sequenziamento dellintera regione IGS di P. palmivora individuazione di primer specifici utili per lo sviluppo di un protocollo diagnostico molecolare.

24 ATTIVITA 2.3 Diagnosi di patogeni fungini in vivaio Obiettivi Necessità per i laboratori accreditati di protocolli diagnostici semplici, rapidi ed affidabili per gli accertamenti fitosanitari per V. dahliae Phytophthora spp. produzione di piantine di olivo dotate di elevati standard 3) Sviluppo di un metodo molecolare (possibilmente Real-time PCR) per la diagnosi della/e specie di Phytophthora più frequenti in vivaio. 1) Validazione di un protocollo diagnostico molecolare (Real- time Scorpion-PCR) per V. dahliae 2) Monitoraggio delle specie di Phytophthora patogene di olivo presenti in vivai pugliesi (corretta identificazione, determinazione della patogenicità, numero di propaguli)

25 2.3 Diagnosi di patogeni fungini in vivaio Attività previste 1. Raccolta di campioni di terreno, miscele e piantine di olivo in vivai Verticillium dahliae 2. Saggi diagnostici con tecnica tradizionale e molecolare (Real-time Scorpion-PCR) su campioni di terreno e di piantine sia prelevati in vivaio che inoculati artificialmente con il patogeno 3. Comparazione statistica dei risultati ottenuti con le due metodiche: test di significatività sulla affidabilità della dimensione del campione e della metodica molecolare.

26 ATTIVITA 2.3 Diagnosi patogeni fungini in vivaio – Attività previste Phytophtora spp. 1. Raccolta, identificazione e caratterizzazione morfologica (chiavi tassonomiche e ceppi di riferimento di collezioni internazionali) di Phytophtora spp. presenti sulle varietà di olivo più diffuse nei vivai 3. Individuazione di primers nella regione IGS e prove di specificità su DNA estratto da coltura pura, da campioni di terreno e radichette inoculate artificialmente 2. Saggi di patogenicità in ambiente controllato

27 ATTIVITA 2.3 Diagnosi patogeni fungini in vivaio – Attività previste Phytophtora spp. 4. Saggi diagnostici con metodica tradizionale e molecolare su campioni di terreno e radichette di olivo prelevati da piantine di olivo in vivaio risultate infette nel corso del monitoraggio 5. Individuazione della dimensione del campione e comparazione statistica tra i risultati ottenuti con le due metodiche

28 ATTIVITA 2.1, 2.3 Diagnosi fitopatologica RISULTATI ATTESI - CONCLUSIONI Nuovi protocolli diagnostici, rapidi e affidabili, in alternativa al dsRNA e per lidentificazione multipla dei virus dellolivo Dati sulla situazione fitosanitaria, con particolare riferimento ai problemi virologici, di ecotipi e di cultivar locali di olivo in tutte le regioni interessate al progetto Dati sui problemi fitosanitari che più frequentemente si riscontrano in vivaio e individuazione dei punti critici che compromettono la sanità delle piante in vivaio

29 ATTIVITA 2.1 e 2.3 Diagnosi fitopatologica RISULTATI ATTESI - CONCLUSIONI Protocollo per la diagnosi molecolare della/e specie più frequente di Phytophthora Protocollo per la diagnosi molecolare di V. dahliae Dati sulla incidenza dellinfezione radicale e sulla densità di inoculo della/e specie di Phytophthora agenti di marciume radicale sulle piantine di olivo

30 Protocolli comuni da utilizzare per i controlli fitosanitari sui materiali di propagazione in ogni fase della filiera di certificazione: - selezione sanitaria; - risanamento; - conservazioni fonti primarie; - commercializzazione. ATTIVITA 2.1 e 2.3 Diagnosi fitopatologica RISULTATI ATTESI - CONCLUSIONI Selezione/Produzione di ecotipi esenti dagli organismi patogeni contemplati dalle normative

31 PAESIN° CAMPIONI SAGGIATIPOSITIVIINFEZIONI (%) ITALY EGYPT GREECE LEBANON MALTA10440 PALESTINE11764 CIPRO6233 SPAIN TUNISIA AUSTRALIA6350 MAROCCO10880 USA TOTALE Risultati dei saggi mediante dsRNA su campioni di olivo provenienti da diversi Paesi


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