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La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera.

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Presentazione sul tema: "La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera."— Transcript della presentazione:

1 La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

2 DEFINIZIONE

3 La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

4 VARIBILITA' NATURALE ESITO DELLA PRESSIONE SELETTIVA

5 La barriera genetica esprime lentità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente)

6 DEFINIZIONE NUMERO DI MUTAZIONI

7 La barriera genetica esprime lentità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente)

8 Bassa barriera genetica Barriera genetica intermedia Elevata barriera genetica Virus resistente, terapia non più efficace Virus sensibile, terapia efficace

9 DEFINIZIONE TIPO DI MUTAZIONI

10 La barriera genetica esprime lentità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente)

11 A A G G C C T,U Purine Pirimidine trasversione transizione Le transizioni sono evolutivamente favorite rispetto alle trasversioni VirusRapporto transizione : trasversione HIV1.5:1 HCV50:1

12 Il sistema cellulare APOBEC3 induce mutazioni G A in HIV come meccanismo di difesa (genetic meltdown) HIV ostacola questo meccanismo bloccando APOBEC3 mediante la propria proteina accessoria Vif Le transizioni G A sono quindi favorite

13 Hultquist, Future Virol 2009

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16 Kulkarni, IHDRW 2011

17 Kulkarni, JAIDS 2012

18 DEFINIZIONE IMPATTO SU FITNESS

19 La barriera genetica esprime lentità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente)

20 La fitness di una variante è definita dalla sua capacità di contribuire alla successiva generazione La fitness è sempre funzione delle condizioni in cui la variante virale si moltiplica (es. variabili correlate ai farmaci e alla risposta immunitaria) Le diverse varianti competono fra di loro con esiti dipendenti dalle condizioni esterne

21 La fitness di un mutante può essere misurata in vari tipi di sistemi virus- cellula in vitro Non cè un gold standard di metodo riconosciuto

22 Pressione farmacologica Sospensione / cambio terapia Virus wild type

23 Fast disappearance Prolonged persistence T20-resistance (HR1) Most major PI mutations 65R 74V 184V TAMsMost minor PI mutations NNRTI mutations RT 215 revertants R5 X4 Tropism switch IN mutations

24 MISURAZIONE BARRIERA IN VITRO

25 La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

26 IC50, dose di farmaco che inibisce del 50% la produzione di virus Valore meno corrispondente alla reale inibizione ma misurazione più accurata (usato spesso) IC90, dose di farmaco che inibisce del 90% la produzione di virus Valore più corrispondente alla reale inibizione ma misurazione poco accurata (usato raramente) La terapia ha selezionato una variante virale farmacoresistente

27 TMC114: an increased genetic barrier to the development of resistance in vitro De Meyer S, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49: De Meyer S, et al. XV IHDRW, 2006, Poster 19. Time (days) Increase in PI selection concentration TMC114 (R41T, K70E) RTV (G16E, M46I, V82F, I84V) SQV (G48V, A71V, G73S, I84V, L90M) NFV (L10F, D30N, R41K, K45I, M46I, V77I, I84V, N88D) APV (L10F, V32I, L33F, M46I, I47V, I50V) LPV (L10F, L23I, M46I, I50V, I54V, L63P, V82A) TPV (L33V, M46L, V82T) ATV (L10F, V32I, M46I, I62V, A71V, I84V, N88S)

28 Virus breakthrough (%) Days post-infection NVP (1µM) EFV (1µM) Control TMC125 (1µM) TMC125 (0.2µM) TMC125 suppresses the in vitro selection of resistant HIV-1 from wild-type, suggesting an increased genetic barrier to the development of HIV drug resistance Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79: Selezione di resistenza in vitro a NVP, EFV, ETV a partire da wild type

29 Azijn, AAC 2010 Starting from wild type HIV (IIIB)

30 Seki, CROI 2010

31 BARRIERA DEI VARI FARMACI

32 DRV/rtv TPV/rtvAltri PI/rtvNRTI non XTC / ETV RPV? / DTG?RTG EVG?XTC / NVP EFV / T20

33 Binding affinity of DRV to HIV-1 protease >100-fold higher compared with PIs due to much slower dissociation Decrease in binding affinity of all PIs on MDR protease mainly caused by increased dissociation rate In contrast to other PIs, decreases in DRV binding affinity of up to 1000-fold do not compromise antiviral activity Multiple simultaneous mutations required to make the virus resistant to DRV (i. e. increased genetic barrier) Dierynck, JV 2007

34

35 MISURAZIONE BARRIERA IN SILICO

36 Model HIV evolution under therapy from longitudinal and cross-sectional sequence data For any defined genotype, neighbor mutants can be computed in silico and the contribution of the expected mutants to resistance can be calculated Functions weight for probability and expected time for mutants to occur Probability to remain susceptible to a drug (below a defined phenotypic threshold) GENETIC BARRIER Probability to remain susceptible to a drug (below a defined phenotypic threshold) GENETIC BARRIER Altmann et al, AVT 2007 Il sistema predittivo bioinformatico della risposta al trattamento EuResist (www.euresist.org) si basa su tre diverse engine, una delle quali calcola la barriera genetica della variante viralewww.euresist.org

37 FATTORI CHE ALTERANO LA BARRIERA POLIMORFISMI

38 La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

39 MutationSubtypes with increased barrier* Subtypes with decreased barrier* PR I82AC G PR I82TC G RT V106MC RT V108IG RT V118IG RT Q151MD F RT L210WC F G AG RT P225HA Based on analysis of 68 A, 1299 B, 209 C, 24 D, 26 F, 86 G, 20 J, 51 AE, 71 AG sequences from drug-naïve individuals *With respect to subtype B. Example: subB 86% Q151M: CAG ATG (2 transversions) 12% Q151M:CAA ATG (1 transition, 2 transversions) subF 13% Q151M: CAG ATG (2 transversions) 83% Q151M:CAA ATG (1 transition, 2 transversions)

40 The prevalence of TPV-RAMs* in HIV-1 subtype A/E and subtype B. *K20M, E35G, K43T, I47V, I54A/M/V, Q58E, T74P, V82L/T, N83D and I84V were not found (Sungkanuparph, JCV 2007).

41 FATTORI CHE ALTERANO LA BARRIERA FALLIMENTI

42 Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773–82 Selezione di resistenza in vitro a ETV a partire da Y181C o da K103N Wild type Y181C K103N

43 ControlTMC125 (0.2µM) TMC125 40nMTMC125 (1µM) Days post-infection Virus breakthrough (%) Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79: Selezione di resistenza in vitro a ETV a partire da Y181C + K103N

44 Azijn, AAC 2010 Reference data on wild type virus

45 1st failure 2nd failure 3rd failure N th failure

46 Le mutazioni selezionate dai precedenti regimi terapeutici abbassano la barriera Resistenza acquisita Resistenza trasmessa Risposta virologica a 24 settimane di regime terapeutico contenente Darunavir nei trial DUET e POWER (pazienti pretrattati con altri PI)

47 Le mutazioni selezionate dai precedenti regimi terapeutici abbassano la barriera Resistenza acquisita Resistenza trasmessa

48 FATTORI CHE ALTERANO LA BARRIERA RESISTENZA & EPITOPI

49 Kent, Trends Microbiol 2005

50 Epitopi B/T possono includere siti di mutazioni di resistenza A seconda dellaplotipo HLA del paziente, queste mutazioni possono essere favorite oppure ostacolate dalla pressione selettiva immunologica Possibili alterazioni della barriera di un farmaco a livello di individuo Ancora unarea di indagine KMIGGIGGF (KF9) è un epitopo CTL HLA-B*1501- ristretto che comprende diverse mutazioni di resistenza ai PI (M46I/L, I47A/V, G48V, I50V) Mueller, JAIDS 2011

51 Epitopi B/T possono includere siti di mutazioni di resistenza A seconda dellaplotipo HLA del paziente, queste mutazioni possono essere favorite oppure ostacolate dalla pressione selettiva immunologica Possibili alterazioni della barriera di un farmaco a livello di individuo Ancora unarea di indagine Gatanaga, AIDS 2010

52 BARRIERA DEL REGIME

53 La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

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55 Resistance to AZT develops quickly AZT 3TC IDV Resistance to whole regimen develops slowly

56 Initial resistance (3TC) Combination therapy (e.g. AZT+3TC+IDV) AZT Third step (AZT+3TC+IDV) Second step (AZT+3TC) 3TC IDV AZT 3TC IDV AZT 3TC IDV

57 Initial resistance (3TC) Combination therapy (e.g. AZT+3TC+IDV) Third step (AZT+3TC+IDV) Second step (AZT+3TC) AZT 3TC IDV AZT 3TC IDV AZT 3TC IDV Local dissociation of combination therapy: stepwise accumulation of resistance

58 Inizio parte Stefano Bonora


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