Sommario La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza

Presentazione sul tema: "Sommario La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza"— Transcript della presentazione:

1 Sommario La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

2 DEFINIZIONE

3 Sommario La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

4 Selezione dei mutanti resistenti
La selezione dei mutanti resistenti è il risultato della pressione della terapia antiretrovirale sulla variabilità di base di HIV secondo uno schema di tipo Darwiniano. ESITO DELLA PRESSIONE SELETTIVA VARIBILITA' NATURALE

5 Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente) Un concetto fondamentale nella comprensione e nell’impostazione della terapia antiretrovirale è la barriera genetica nei confronti della resistenza. Con questa terminologia si intende la facilità o difficoltà con cui un determinato ceppo virale (in prima istanza il virus wild type) evolve verso la resistenza ad un determinato farmaco. Nel suo senso originario la barriera genetica riguarda quindi il comportamento di un singolo farmaco nei confronti del virus wild type. La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness)

6 DEFINIZIONE NUMERO DI MUTAZIONI

7 Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente) Il primo fattore intuitivamente connesso alla barriera genetica, tale da costituirne di solito la definizione stessa, è il numero di mutazioni necessario per il passaggio da virus sensibile a virus resistente. E’ ben noto ad esempio che una singola mutazione specifica è in grado di abolire del tutto l’attività di farmaci come 3TC o EFV mentre sono necessarie più mutazioni per ottenere un effetto apprezzabile di riduzione di efficacia dei PI con booster di ritonavir (bPI). La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness)

8 Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Virus resistente, terapia non più efficace       A seconda del numero di mutazioni necessarie per il raggiungimento del fenotipo resistente i vari farmaci possono quindi essere catalogati in antiretrovirali a barriera bassa, intermedia o elevata. Bassa barriera genetica Barriera genetica intermedia Elevata barriera genetica Virus sensibile, terapia efficace

9 DEFINIZIONE TIPO DI MUTAZIONI

10 Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente) Un aspetto meno frequentemente tenuto presente è la tipologia delle mutazioni coinvolte nella barriera. La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness)

11 Il bias di selezione fra transizioni e trasversioni
C G T,U Purine E’ infatti noto che in tutti i sistemi evolutivi il cambiamento fra basi della stessa natura chimica (da purina a purina o da pirimidina a pirimidina), detto transizione, è favorito rispetto a quello fra basi di diversa natura chimica (da purina a pirimidina e viceversa), detto trasversione. In base a sistemi modello in vitro e ad osservazioni in vivo (Leitner 1997, Park 2007) il bias transizione:trasversione in HIV è di circa 1,5:1. Si tratta in realtà di un bias molto meno elevato rispetto a quello stimato in altri virus, ad es. 50:1 in HCV (Powdrill 2011). Non è tuttavia chiaro quanto sia rilevante in vivo questo bias con HIV. Infatti la mutazione T215Y, una delle più frequenti fra quelle coinvolte nella resistenza agli NRTI, è il risultato di due trasversioni a carico dello stesso codone (ACC –> TAC). Park CS, Kim MS, Yi HA, Lee DH, Lee KM, Lee CH. Analysis of substitution events in HIV-1 vif gene of the Korean clade. J Microbiol. 2007 Feb;45(1):75-8. Leitner T, Kumar S, Albert J. Tempo and mode of nucleotide substitutions in gag and env gene fragments in human immunodeficiency virus type 1 populations with a known transmission history. J Virol Jun;71(6): Contribution of a mutational bias in hepatitis C virus replication to the genetic barrier in the development of drug resistance. Powdrill MH, Tchesnokov EP, Kozak RA, Russell RS, Martin R, Svarovskaia ES, Mo H, Kouyos RD, Götte M. Proc Natl Acad Sci U S A Dec 20;108(51): Pirimidine Le transizioni sono evolutivamente favorite rispetto alle trasversioni trasversione Virus Rapporto transizione : trasversione HIV 1.5:1 HCV 50:1 transizione

12 Il bias di ipermutazione G → A
Il sistema cellulare APOBEC3 induce mutazioni G → A in HIV come meccanismo di difesa (genetic meltdown) HIV ostacola questo meccanismo bloccando APOBEC3 mediante la propria proteina “accessoria” Vif Le transizioni G → A sono quindi favorite Una seconda considerazione che riguarda specificamente i retrovirus e quindi HIV è l’ipermutazione G –> A. Questo meccanismo è il risultato di un sistema innato di difesa cellulare mediato dalle proteine del complesso APOBEC. Si tratta di un’attività di citidina deaminasi che comporta appunto la transizione G –> A, variazione in effetti molto frequente nell’evoluzione di HIV. In teoria una barriera che può essere aggirata da mutazioni del tipo G –> A è meno solida di una barriera che può essere aggirata mediante altre mutazioni. L’importanza di questo meccanismo difensivo è testimoniata dalla presenza del gene vif nel genoma di HIV. Vif blocca infatti il sistema APOBEC rendendolo inefficace. E’ probabile che le varianti alleliche di vif abbiano una diversa capacità anti-APOBEC ma questo tema è ancora da chiarire. Probabilmente HIV ha evoluto vif in modo da beneficiare della variabilità indotta da APOBEC senza esserne sopraffatto (Hultquist 2009). Hultquist JF, Harris RS. Leveraging APOBEC3 proteins to alter the HIV mutation rate and combat AIDS. Future Virol Nov 1;4(6):605.

13 Il bias di ipermutazione G → A
Hultquist, Future Virol 2009

14 Ipermutazione G → A Recentemente è stato dimostrato che il livello di espressione, e quindi verosimilmente l’attività, di APOBEC3G correla inversamente con la carica virale in vivo (Kourteva 2012). Kourteva Y, De Pasquale M, Allos T, McMunn C, D'Aquila RT. APOBEC3G expression and hypermutation are inversely associated with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) burden in vivo. Virology Aug 15;430(1):1-9.

15 Ipermutazione G → A E138K: GAG → AAG M184I: ATG → ATA
Una situazione in cui l’ipermutazione G –> A favorita dal sistema APOBEC potrebbe essere sfruttata a vantaggio di HIV è la selezione della resistenza alla rilpivirina (RPV) dimostrata nei trial ECHO e THRIVE (Rimsky 2012). La resistenza alla RPV si basa infatti fondamentalmente sulla doppia mutazione E138K/M184I. Entrambe queste mutazioni sono in effetti il risultato di una transizione G –> A e possono pre-esistere in assenza di terapia nei reservoir virali (Fourati 2012). Rimsky L, Vingerhoets J, Van Eygen V, Eron J, Clotet B, Hoogstoel A, Boven K, Picchio G. Genotypic and phenotypic characterization of HIV-1 isolates obtained from patients on rilpivirine therapy experiencing virologic failure in the phase 3 ECHO and THRIVE studies: 48-week analysis. J Acquir Immune Defic Syndr Jan 1;59(1):39-46. Fourati S, Malet I, Lambert S, Soulie C, Wirden M, Flandre P, Fofana DB, Sayon S, Simon A, Katlama C, Calvez V, Marcelin AG. E138K and M184I mutations in HIV-1 reverse transcriptase co-emerge as a result of APOBEC3 editing in the absence of drug exposure. AIDS Jun 12. [Epub ahead of print]

16 Mutazioni di resistenza a Rilpivirina nei trial ECHO & THRIVE
Il doppio mutante E138K/M184I è la variante RPV-resistente più frequentemente osservata in vivo al fallimento della terapia con RPV (Rimsky 2012). Rimsky L, Vingerhoets J, Van Eygen V, Eron J, Clotet B, Hoogstoel A, Boven K, Picchio G. Genotypic and phenotypic characterization of HIV-1 isolates obtained from patients on rilpivirine therapy experiencing virologic failure in the phase 3 ECHO and THRIVE studies: 48-week analysis. J Acquir Immune Defic Syndr Jan 1;59(1):39-46. Kulkarni, IHDRW 2011

17 M184I diminuisce la suscettibilità a Rilpivirina più di M184V
Né le singole mutazioni E138K o M184I né la combinazione E138K/M184V conferiscono il livello di resistenza associato alla coppia di mutazioni E138K/M184I (Kulkarni 2012). Kulkarni R, Babaoglu K, Lansdon EB, Rimsky L, Van Eygen V, Picchio G, Svarovskaia E, Miller MD, White KL. The HIV-1 reverse transcriptase M184I mutation enhances the E138K-associated resistance to rilpivirine and decreases viral fitness. J Acquir Immune Defic Syndr Jan 1;59(1):47-54. Kulkarni, JAIDS 2012

18 DEFINIZIONE IMPATTO SU FITNESS

19 Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente) Il terzo fattore da considerare come certamente rilevante nel concetto di barriera genetica è l’impatto che le mutazioni necessarie ad aggirare la barriera stessa hanno sulla fitness del virus. La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness)

20 Fitness dei mutanti virali
La fitness di una variante è definita dalla sua capacità di contribuire alla successiva generazione La fitness è sempre funzione delle condizioni in cui la variante virale si moltiplica (es. variabili correlate ai farmaci e alla risposta immunitaria) Le diverse varianti competono fra di loro con esiti dipendenti dalle condizioni esterne La fitness dei vari mutanti è notoriamente importante nel determinare il successo evolutivo delle varianti stesse. Il livello di fitness di una variante determina la capacità di quella variante di generare una progenie virale che competa favorevolmente con le altre quasispecie in un determinato ambiente (in vitro o in vivo) ed è pertanto un concetto dinamico e strettamente dipendente dalle condizioni in cui il virus replica.

21 Misurazione della fitness in vitro
La fitness di un mutante può essere misurata in vari tipi di sistemi virus-cellula in vitro Non c’è un gold standard di metodo riconosciuto La fitness può essere misurata in vitro mediante sistemi controllati virus-cellula abbastanza complessi e tutt’altro che standardizzati. Il calcolo della fitness in questi sistemi è eseguito applicando vari modelli matematici senza che sia stato finora raggiunto un gold standard metodologico.

22 La cinetica di decadimento dei mutanti off-therapy come indice della fitness in vivo
Virus wild type Pressione farmacologica Una possibile valutazione della fitness in vivo può essere indirettamente ottenuta con il monitoraggio del tempo di decadimento di un mutante allorchè la terapia è interrotta. In tal caso la velocità con cui il mutante cessa di essere rivelabile è inversamente proporzionale alla fitness del mutante stesso il quale compete con le quasispecie virali in un ambiente variato proprio a causa della cessazione della pressione selettiva farmacologica. Sospensione / cambio terapia

23 La cinetica di decadimento dei mutanti off-therapy come indice della fitness in vivo
T20-resistance (HR1) Most major PI mutations 65R 74V 184V IN mutations TAMs Most minor PI mutations NNRTI mutations RT 215 “revertants” R5 → X4 Tropism switch In tal modo è stato possibile stabilire una sorta di ordinamento dei più comuni mutanti in base alla loro fitness in vivo (Devereux 2011, Halfon 2003, Bi 2007, Trignetti 2007, Ferns 2009). Deve essere tuttavia considerato che l’insieme dei polimorfismi e delle altre mutazioni di resistenza associate alla mutazione di interesse può alterare la cinetica di decadimento di quest’ultima redendo la valutazione meno affidabile. Bi X, Gatanaga H, Koike K, Kimura S, Oka S. Reversal periods and patterns from drug-resistant to wild-type HIV type 1 after cessation of anti-HIV therapy. AIDS Res Hum Retroviruses Jan;23(1):43-50. Devereux HL, Emery VC, Johnson MA, Loveday C. Replicative fitness in vivo of HIV-1 variants with multiple drug resistance-associated mutations. J Med Virol Oct;65(2): Ferns RB, Kirk S, Bennett J, Cook PM, Williams I, Edwards S, Pillay D. The dynamics of appearance and disappearance of HIV-1 integrase mutations during and after withdrawal of raltegravir therapy. AIDS Oct 23;23(16): Halfon P, Durant J, Clevenbergh P, Carsenti H, Celis L, Khiri H, De Smet K, De Brauwer A, Hulstaert F, Dellamonica P. Kinetics of disappearance of resistance mutations and reappearance of wild-type during structured treatment interruptions. AIDS Jun 13;17(9): Trignetti M, Sing T, Svicher V, Santoro MM, Forbici F, D'arrigo R, Bellocchi MC, Santoro M, Marconi P, Zaccarelli M, Trotta MP, Bellagamba R, Narciso P, Antinori A, Lengauer T, Perno CF, Ceccherini-Silberstein F. Dynamics of NRTI resistance mutations during therapy interruption. AIDS Res Hum Retroviruses Jan;25(1):57-64. Fast disappearance Prolonged persistence

24 MISURAZIONE BARRIERA IN VITRO

25 Sommario La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

26 La terapia ha selezionato una variante virale farmacoresistente
Misurazione dell'attività antivirale in vitro (IC = Inhibitory Concentration) La misurazione diretta della barriera genetica in vitro si fonda sui classici esperimenti di selezione di resistenza nei quali si applicano dosi sub-inibenti crescenti di farmaco e si valuta la capacità del virus di eludere l’attività del farmaco tramite una o più mutazioni. L’esperimento simula gli eventi di selezione di resistenza in vivo. La terapia ha selezionato una variante virale farmacoresistente IC50, dose di farmaco che inibisce del 50% la produzione di virus Valore meno corrispondente alla reale inibizione ma misurazione più accurata (usato spesso) IC90, dose di farmaco che inibisce del 90% la produzione di virus Valore più corrispondente alla reale inibizione ma misurazione poco accurata (usato raramente)

27 Increase in PI selection concentration
TMC114: an increased genetic barrier to the development of resistance in vitro Time (days) Increase in PI selection concentration 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 700 900 1100 TMC114 (R41T, K70E) RTV (G16E, M46I, V82F, I84V) SQV (G48V, A71V, G73S, I84V, L90M) NFV (L10F, D30N, R41K, K45I, M46I, V77I, I84V, N88D) APV (L10F, V32I, L33F, M46I, I47V, I50V) LPV (L10F, L23I, M46I, I50V, I54V, L63P, V82A) TPV (L33V, M46L, V82T) ATV (L10F, V32I, M46I, I62V, A71V, I84V, N88S) Ad esempio con esperimenti di questo tipo si dimostra che la barriera del darunavir (DRV) è più elevata di quella degli altri PI in quanto il tempo necessario per selezionare varianti DRV-resistenti è sensibilmente superiore (De Meyer 2005). De Meyer S, Azijn H, Surleraux D, Jochmans D, Tahri A, Pauwels R, Wigerinck P, de Béthune MP. TMC114, a novel human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitor active against protease inhibitor-resistant viruses, including a broad range of clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother Jun;49(6): De Meyer S, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49: De Meyer S, et al. XV IHDRW, 2006, Poster 19.

28 Virus breakthrough (%)
Selezione di resistenza in vitro a NVP, EFV, ETV a partire da wild type Virus breakthrough (%) Days post-infection 4 8 11 15 18 21 24 27 31 20 40 60 80 100 NVP (1µM) EFV (1µM) Control TMC125 (1µM) TMC125 (0.2µM) Analogamente per la classe degli NNRTI, etravirina mostra una barriera superiore a nevirapina e ad efavirenz (Vingerhoets 2005). TMC125 displays a high genetic barrier to the development of resistance: evidence from in vitro selection experiments. Vingerhoets J, Azijn H, Fransen E, De Baere I, Smeulders L, Jochmans D, Andries K, Pauwels R, de Béthune MP. J Virol Oct;79(20): TMC125 suppresses the in vitro selection of resistant HIV-1 from wild-type, suggesting an increased genetic barrier to the development of HIV drug resistance Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:

29 Selezione di resistenza in vitro a RPV
La barriera di rilpivirina è analoga a quella di etravirina e quindi anch’essa superiore a nevirapina e ad efavirenz (Azijn 2010). Azijn H, Tirry I, Vingerhoets J, de Béthune MP, Kraus G, Boven K, Jochmans D, Van Craenenbroeck E, Picchio G, Rimsky LT. TMC278, a next-generation nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor (NNRTI), active against wild-type and NNRTI-resistant HIV-1. Antimicrob Agents Chemother Feb;54(2): Starting from wild type HIV (IIIB) Azijn, AAC 2010

30 La barriera genetica verso la resistenza in vitro è più elevata per dolutegravir ripetto a raltegravir Nella classe degli INI, dolutegravir ha barriera superiore a quella degli INI di prima generazione, raltegravir ed elvitegravir (Seki 2010). Takahiro Seki, M Kobayashi, C Wakasa-Morimoto, T Yoshinaga, A Sato, T Fujiwara, M Underwood, E Garvey, B Johns. S/GSK is a Potent Next Generation HIV Integrase Inhibitor and Demonstrates a Superior Resistance Profile Substantiated with 60 Integrase Mutant Molecular Clones. 10th CROI, 2010. Seki, CROI 2010 30

31 BARRIERA DEI VARI FARMACI

32 Barriera genetica dei singoli antiretrovirali
DRV/rtv TPV/rtv Altri PI/rtv NRTI non XTC / ETV RPV? / DTG? RTG EVG? XTC / NVP EFV / T20 In base ai dati in vitro e in vivo, è possibile sistemare, con qualche margine di aleatorietà, i vari farmaci in base al livello della loro barriera.

33 Slow dissociation of DRV as a major contribution to tight binding to HIV protease
Binding affinity of DRV to HIV-1 protease >100-fold higher compared with PIs due to much slower dissociation Decrease in binding affinity of all PIs on MDR protease mainly caused by increased dissociation rate In contrast to other PIs, decreases in DRV binding affinity of up to 1000-fold do not compromise antiviral activity Multiple simultaneous mutations required to make the virus resistant to DRV (i. e. increased genetic barrier) Un contributo importante associato alla barriera elevata nella classi dei PI e degli INI sembra essere la maggiore lentezza di dissociazione del farmaco dal proprio bersaglio, più che la forza di legame. Ciò è infatti evidente negli esperimenti biochimici con DRV nella classe dei PI … Dierynck I, De Wit M, Gustin E, Keuleers I, Vandersmissen J, Hallenberger S, Hertogs K. Binding kinetics of darunavir to human immunodeficiency virus type 1 protease explain the potent antiviral activity and high genetic barrier. J Virol Dec;81(24): Dierynck, JV 2007

34 …e con dolutegravir nella classe degli INI.
Hightower KE, Wang R, Deanda F, Johns BA, Weaver K, Shen Y, Tomberlin GH, Carter HL 3rd, Broderick T, Sigethy S, Seki T, Kobayashi M, Underwood MR. Dolutegravir (S/GSK ) exhibits significantly slower dissociation than raltegravir and elvitegravir from wild-type and integrase inhibitor-resistant HIV-1 integrase-DNA complexes. Antimicrob Agents Chemother Oct;55(10):

35 MISURAZIONE BARRIERA IN SILICO

36 EuResist – Evolutionary engine
Model HIV evolution under therapy from longitudinal and cross-sectional sequence data For any defined genotype, neighbor mutants can be computed in silico and the contribution of the expected mutants to resistance can be calculated La barriera genetica di un farmaco è un fattore cosi rilevante che essa è stata integrata anche nei modelli matematici di alcuni sistemi esperti di nuova generazione per la predizione della risposta al trattamento, come ad esempio il motore EuResist. Questo sistema adopera tre diverse “engine” probabilistiche, una delle quali considera soprattutto la barriera genetica della variante virale individuata nel paziente (Altmann 2007). Altmann A, Beerenwinkel N, Sing T, Savenkov I, Doumer M, Kaiser R, Rhee SY, Fessel WJ, Shafer RW, Lengauer T. Improved prediction of response to antiretroviral combination therapy using the genetic barrier to drug resistance. Antivir Ther. 2007;12(2): Functions weight for probability and expected time for mutants to occur Il sistema predittivo bioinformatico della risposta al trattamento EuResist ( si basa su tre diverse engine, una delle quali calcola la barriera genetica della variante virale Probability to remain susceptible to a drug (below a defined phenotypic threshold) GENETIC BARRIER Altmann et al, AVT 2007

37 FATTORI CHE ALTERANO LA BARRIERA POLIMORFISMI

38 Sommario La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

39 The Calculated Genetic Barrier for Antiretroviral Drug Resistance Substitutions Is Largely Similar for Different HIV-1 Subtypes (van de Vijver et al., JAIDS 2006) Mutation Subtypes with increased barrier* Subtypes with decreased barrier* PR I82A C G PR I82T RT V106M C RT V108I G RT V118I RT Q151M D F RT L210W C F G AG RT P225H A Dato l’elevato polimorfismo naturale di HIV, è ragionevole attendersi che sottotipi diversi possano presentare variazioni di barriera genetica nei confronti della resistenza a specifici farmaci in virtù delle variazioni genetiche che li contraddistinguono. Un’analisi estensiva condotta sulle sequenze disponibili qualche anno fa (va de Vijver 2006) ha tuttavia concluso che le variazioni di barriera dovute alle preferenze aminoacidiche nei diversi sottotipi sono relativamente modeste. Tuttavia esistono alcune differenze che possono comportare propensioni distinte all’evoluzione di specifici quadri di resistenza lungo linee meno elevate di barriera genetica. van de Vijver DA, Wensing AM, Angarano G, Asjö B, Balotta C, Boeri E, Camacho R, Chaix ML, Costagliola D, De Luca A, Derdelinckx I, Grossman Z, Hamouda O, Hatzakis A, Hemmer R, Hoepelman A, Horban A, Korn K, Kücherer C, Leitner T, Loveday C, MacRae E, Maljkovic I, de Mendoza C, Meyer L, Nielsen C, Op de Coul EL, Ormaasen V, Paraskevis D, Perrin L, Puchhammer-Stöckl E, Ruiz L, Salminen M, Schmit JC, Schneider F, Schuurman R, Soriano V, Stanczak G, Stanojevic M, Vandamme AM, Van Laethem K, Violin M, Wilbe K, Yerly S, Zazzi M, Boucher CA. The calculated genetic barrier for antiretroviral drug resistance substitutions is largely similar for different HIV-1 subtypes. J Acquir Immune Defic Syndr Mar;41(3): *With respect to subtype B. Example: subB 86% Q151M: CAG  ATG (2 transversions) 12% Q151M: CAA  ATG (1 transition, 2 transversions) subF 13% Q151M: CAG  ATG (2 transversions) 83% Q151M: CAA  ATG (1 transition, 2 transversions) Based on analysis of 68 A, 1299 B, 209 C, 24 D, 26 F, 86 G, 20 J, 51 AE, 71 AG sequences from drug-naïve individuals

40 Mutations contributing to resistance to high genetic barrier PIs in different subtypes
Con i PI a più elevata barriera, proprio in considerazione del numero elevato di mutazioni necessarie al raggiungimento del fenotipo resistente, accade che in alcuni sottotipi si possa avere una prevalenza significativamente superiore di una o più mutazioni coinvolte nella barriera. Ciò configura la possibilità di una ridotta barriera nei sottotipi corrispondenti (Sungkanuparph 2007) anche se le prove di un impatto clinico rilevante di questo fenomeno non sono finora state ottenute in modo convincente. Sungkanuparph S, Sukasem C, Manosuthi W, Wiboonchutikul S, Piyavong B, Chantratita W. Tipranavir resistance associated mutations in protease inhibitor-naïve patients with HIV-1 subtype A/E infection. J Clin Virol Nov;43(3):284-6. The prevalence of TPV-RAMs* in HIV-1 subtype A/E and subtype B. *K20M, E35G, K43T, I47V, I54A/M/V, Q58E, T74P, V82L/T, N83D and I84V were not found (Sungkanuparph, JCV 2007).

41 FATTORI CHE ALTERANO LA BARRIERA FALLIMENTI

42 Selezione di resistenza in vitro a ETV a partire da Y181C o da K103N
Wild type Il fattore che condiziona più fortmente la barriera genetica è la presenza di mutazioni selezionate precedentemente dall’esposizione ad altri farmaci. L’impatto delle mutazioni pre-esistenti può essere facilmente evidenziato in esperimenti di selezione di resistenza in vitro a partire da vari mutanti tenendo come riferimento la cinetica di selezione di resistenza a partire dal wild-type. Ad esempio, la selezione di resistenza a etravirina è favorita dalla pre-esistenza di Y181C (Vingerhoets 2005). Vingerhoets J, Azijn H, Fransen E, De Baere I, Smeulders L, Jochmans D, Andries K, Pauwels R, de Béthune MP. TMC125 displays a high genetic barrier to the development of resistance: evidence from in vitro selection experiments. J Virol Oct;79(20): K103N Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773–82

43 Selezione di resistenza in vitro a ETV a partire da Y181C + K103N
Days post-infection 100 80 60 40 20 Virus breakthrough (%) La selezione di resistenza a aprtire dal doppio mutante K103N/Y181C risulta molto rapida a testimoniare come la barriera sia in questo caso ridotta (Vingerhoets 2005). Vingerhoets J, Azijn H, Fransen E, De Baere I, Smeulders L, Jochmans D, Andries K, Pauwels R, de Béthune MP. TMC125 displays a high genetic barrier to the development of resistance: evidence from in vitro selection experiments. J Virol Oct;79(20): Control TMC125 (0.2µM) TMC125 40nM TMC125 (1µM) Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:

44 Selezione di resistenza in vitro a RPV
La barriera di rilpivirina rimane inalterata nei confronti dei mutanti K103N o Y181C, rispetto al wild type, negli esperimenti condotti fino a 32 giorni (Azijn 2010). Azijn H, Tirry I, Vingerhoets J, de Béthune MP, Kraus G, Boven K, Jochmans D, Van Craenenbroeck E, Picchio G, Rimsky LT. TMC278, a next-generation nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor (NNRTI), active against wild-type and NNRTI-resistant HIV-1. Antimicrob Agents Chemother Feb;54(2): Reference data on wild type virus Azijn, AAC 2010

45 I fallimenti di terapia abbassano la barriera genetica
Nth failure 3rd failure La maggiore facilità con cui un farmaco seleziona resistenza in vitro a partire da una variante virale che ha già una o più mutazioni importanti per lo stesso farmaco trova applicazione anche in vivo. In questo caso la barriera genetica sarà evidentemente tanto più diminuita quanto più elevato è il numero di mutazioni già presenti allorché il farmaco viene a contatto con la popolazione virale. Nel paziente pretrattato la riduzione della barriera sarà in generale proporzionale al carico di precedenti fallimenti di terapia. Nel contesto dell’applicazione clinica, in questo meccanismo di riduzione della barriera possono entrare in gioco anche eventuali varianti non più rilevabili come popolazioni dominanti ma presenti come popolazioni minoritarie. 2nd failure 1st failure

46 I fallimenti di terapia abbassano la barriera genetica
Le mutazioni selezionate dai precedenti regimi terapeutici abbassano la barriera Resistenza acquisita Resistenza trasmessa Anche per farmaci a barriera molto elevata come darunavir la precedente esposizione della popolazione virale ai fallimenti di terapia con farmaci della stessa classe porta ad una riduzione della barriera di rilevanza clinica. La risposta virologica risulta infatti condizionata dalla riduzione della barriera genetica (presenza di mutazioni al baseline del trattamento) (De Meyer 2006, Ruane 2006). De Meyer S, Vangeneugden T, Lefebvre E, et al. Phenotypic and genotypic determinants of resistance to TMC114: pooled analysis of POWER 1, 2 and 3. 15th International HIV Drug Resistance Workshop; Sitges, Spain; June 13–17, Abstract 73. Ruane P, Gallant JE, Tennenberg A, Spinoza-Guzman S. Safety and efficacy of darunavir in combination with low-dose ritonavir: 48-week results from the POWER studies. HIV DART: Frontiers in Drug Development for Antiretroviral Therapies; Cancun, Mexico; 10–14 December Abstract 74. Risposta virologica a 24 settimane di regime terapeutico contenente Darunavir nei trial DUET e POWER (pazienti pretrattati con altri PI)

47 I fallimenti di terapia abbassano la barriera genetica
Le mutazioni selezionate dai precedenti regimi terapeutici abbassano la barriera Resistenza acquisita Resistenza trasmessa Analogamente, la barriera genetica può essere ridotta anche in seguito a resistenza trasmessa. La riduzione di barriera potrà avere in questo caso un ruolo clinico se la terapia attuata include farmaci direttamente interessati dal fenomeno, come nel caso del maggior rischio di fallimento della terapia con analoghi timidinici associato alla presenza di popolazione virale con revertanti al codone 215 della RT (Violin 2004). Violin M, Cozzi-Lepri A, Velleca R, Vincenti A, D'Elia S, Chiodo F, Ghinelli F, Bertoli A, d'Arminio Monforte A, Perno CF, Moroni M, Balotta C. Risk of failure in patients with 215 HIV-1 revertants starting their first thymidine analog-containing highly active antiretroviral therapy. AIDS Jan 23;18(2):

48 FATTORI CHE ALTERANO LA BARRIERA RESISTENZA & EPITOPI

49 Escape dalla pressione immunologica
L’evoluzione della popolazione virale in vivo è condizionata anche dalla risposta immunitaria dell’ospite oltre che dalla terapia. Come nei confronti dei farmaci, la popolazione virale seleziona le varianti meno efficacemente riconosciute dal repertorio immunologico del singolo individuo. I meccanismi di escape del riconoscimento immunologico da parte del virus sono in larga misura analoghi a quelli di escape nei confronti dei farmaci, dettati dalla combinazione fra pressione selettiva e fitness dei mutanti. Kent, Trends Microbiol 2005

50 Impatto delle mutazioni di resistenza sul riconoscimento immunologico
KMIGGIGGF (KF9) è un epitopo CTL HLA-B*1501-ristretto che comprende diverse mutazioni di resistenza ai PI (M46I/L, I47A/V, G48V, I50V) Epitopi B/T possono includere siti di mutazioni di resistenza A seconda dell’aplotipo HLA del paziente, queste mutazioni possono essere favorite oppure ostacolate dalla pressione selettiva immunologica Possibili alterazioni della barriera di un farmaco a livello di individuo Ancora un’area di indagine Alcuni epitopi B o T possono includere siti di mutazioni di resistenza (Mueller 2011). Come conseguenza di questa sovrapposizione, l’evoluzione del genoma virale sarà guidata contestualmente sia dalla pressione farmacologica sia dalla pressione immunologica. Una specifica pressione immunologica può favorire variazioni aminoacidiche che comportano variazioni della barriera genetica del virus nei confronti della resistenza ad uno o più farmaci specifici. Data la difficoltà di valutare l’aplotipo HLA di molti pazienti in trattamento questo fenomeno di potenziale rilevanza clinica è ancora area di indagine. Mueller SM, Spriewald BM, Bergmann S, Eismann K, Leykauf M, Korn K, Walter H, Schmidt B, Arnold ML, Harrer EG, Kaiser R, Schweitzer F, Braun P, Reuter S, Jaeger H, Wolf E, Brockmeyer NH, Jansen K, Michalik C, Harrer T; German Competence Network for HIV/AIDS. Influence of major HIV-1 protease inhibitor resistance mutations on CTL recognition. J Acquir Immune Defic Syndr Feb;56(2): Mueller, JAIDS 2011

51 Impatto delle mutazioni di resistenza sul riconoscimento immunologico
Epitopi B/T possono includere siti di mutazioni di resistenza A seconda dell’aplotipo HLA del paziente, queste mutazioni possono essere favorite oppure ostacolate dalla pressione selettiva immunologica Possibili alterazioni della barriera di un farmaco a livello di individuo Ancora un’area di indagine Sono possibili anche esperimenti di simulazione in vitro per definire il ruolo di certi alleli HLA nel guidare l’evoluzione del virus e le possibili alterazioni della barriera genetica (Gatanaga 2010). Gatanaga H, Ode H, Hachiya A, Hayashida T, Sato H, Takiguchi M, Oka S. Impact of human leukocyte antigen-B*51-restricted cytotoxic T-lymphocyte pressure on mutation patterns of nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance. AIDS Mar 13;24(5):F15-22. Gatanaga, AIDS 2010

52 BARRIERA DEL REGIME

53 Sommario La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

54 La terapia combinata rallenta la selezione della resistenza
Le considerazioni sulla barriera genetica dei singoli farmaci devono essere poi trasferite alla terapia antiretrovirale di combinazione. L’aumento della barriera genetica che si ottiene con l’uso della terapia di combinazione, rispetto a quella dei singoli farmaci che la compongono, è in realtà alla base del successo della stessa HAART. Posto che i farmaci che compongono un regime terapeutico siano efficaci, l’evoluzione del virus verso una condizione di resistenza a tutti i farmaci inclusi nel regime stesso sarà infatti enormemente ostacolata. In termini strettamente probabilistici, la frequenza con cui si potrà avere una variante resistente a tutta la terapia sarà uguale al prodotto delle frequenze con cui possono aversi i singoli ceppi resistenti a uno dei farmaci in gioco (una relazione quindi molto più che additiva).

55 Monotherapy vs. combination therapy and risk of resistance
AZT AZT 3TC IDV Questo concetto è facilmente verificabile anche in vitro confrontando il tempo necessario per la selezione di resistenza ad un singolo farmaco e ad un’associazione di farmaci. Resistance to AZT develops quickly Resistance to whole regimen develops slowly

56 Combination therapy and risk of resistance
Combination therapy (e.g. AZT+3TC+IDV) AZT AZT AZT 3TC 3TC 3TC IDV IDV IDV In realtà l’osservazione della selezione di resistenza in vivo può evidenziare, soprattutto con regimi a barriera non elevata, un accumulo graduale della resistenza nei confronti dei vari farmaci, secondo un ordine corrispondente alla loro barriera. Initial resistance (3TC) Second step (AZT+3TC) Third step (AZT+3TC+IDV)

57 Combination therapy and risk of resistance
“Combination” therapy (e.g. AZT+3TC+IDV) AZT AZT AZT 3TC 3TC 3TC IDV IDV IDV Questa evidenza si giustifica con un fenomeno di dissociazione locale della terapia di combinazione. Infatti la prima variante virale resistente ad uno solo dei farmaci impiegati deve essere stata selezionata in una condizione di esposizione prevalente (e sub-inibitoria per insufficiente potenza intrinseca del farmaco o per bassa concentrazione) a quel singolo farmaco. Condizione analoga vale per il successivo step di resistenza. L’accumulo progressivo di resistenza nei confronti delle varie componenti del regime di combinazione, rivelabile mediante campionamenti ravvicinati, suggerisce che proprio l’effettiva combinazione dei vari farmaci a dosaggi efficaci sia un fattore critico per il mantenimento della barriera genetica del regime come presupposto essenziale per il successo della terapia. Initial resistance (3TC) Second step (AZT+3TC) Third step (AZT+3TC+IDV) Local ‘dissociation’ of combination therapy: stepwise accumulation of resistance

58 Inizio parte Stefano Bonora