ENZIMI DI RESTRIZIONE.

Presentazione sul tema: "ENZIMI DI RESTRIZIONE."— Transcript della presentazione:

1 ENZIMI DI RESTRIZIONE

2 Reazione ligasica di frammenti di restrizione

3 Fig 4.20 separation of poly-A mRNA

4 mRNA Purification 1. Total RNA Purification
2. PolyA+ RNA purification using oligo(dT)

5 Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 1
mRNA AAAAAn Anneal oligo dT primer primed mRNA AAAAAn TTTTT Reverse Transcriptase and dNTPs mRNA/cDNA hybrid AAAAAn TTTTT

6 Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 2
mRNA/cDNA hybrid AAAAAn TTTTT RNase H AAAAAn nicked RNA TTTTT DNA Pol I nicked RNA used as primers by Pol AAAAA TTTTT

7 Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 3
2nd strand cDNA in pieces AAAAA TTTTT E. coli DNA Ligase AAAAA ds cDNA TTTTT Clone into vector cDNA Library

8 cDNA synthesis TTTTTTTTT First strand Nick translation cDNA library

9 Vettori e clonaggio Vettori Plasmidi Fagi Cosmidi YAC

10 Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente
Vettori e clonaggio Plasmide Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma.

11 VETTORI DI CLONAGGIO

12 Replicazione di un plasmide
Vettori e clonaggio Replicazione di un plasmide

13 INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

14 CLONAGGIO: -TRASFORMAZIONE -SELEZIONE -CRESCITA COLONIE

15 BATTERICA DI INTERESSE
IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA BATTERICA DI INTERESSE

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17 Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear)
-galactosidase Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) + galactose

18 Inserting chromosomal DNA into a vector
Chromosome GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Vector GAATTC CTTAAG Cut with EcoRI and add DNA ligase Recombinant vector GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Ampicillin resistant; -galactosidase negative (White on X-Gal) LacZ gene codes for -galactosidase Ampicillin resistance gene

19 Bacteria from ligation plated on ampicillin and X-Gal
Contains wild type plasmd Contains recombinant plasmd

20 Vettori e clonaggio

21 DNA clonabile in un plasmide:
Vettori e clonaggio Lunghezza massima del DNA clonabile in un plasmide: circa 20 Kb

22 I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi.
Vettori e clonaggio I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi. Dopo aver infettato una cellula-ospite utilizzano i suoi sistemi di replicazione e sintesi delle proteine per riprodursi

23 I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.
Vettori e clonaggio I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.

24 Vettori e clonaggio Ciclo litico del fago T4

25 Il fago più utilizzato in biologia
Vettori e clonaggio Il fago più utilizzato in biologia molecolare è il fago 

26 Vettori e clonaggio Ciclo litico e lisogenico del fago 

27 Vettori e clonaggio Assemblaggio di un fago 

28 Mappa del genoma del fago 
Vettori e clonaggio Mappa del genoma del fago 

29 Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA nel fago 

30 Formazione di cloni fagici
Vettori e clonaggio Formazione di cloni fagici

31 L’infezione dei batteri con il fago  è circa 103 volte più efficiente
Vettori e clonaggio L’infezione dei batteri con il fago  è circa 103 volte più efficiente della trasformazione con un plasmide

32 Lunghezza del DNA clonabile in un fago: 20-25 Kb
Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un fago: 20-25 Kb

33 Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS
Vettori e clonaggio Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS dal fago 

34 Vettori e clonaggio

35 Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA in un cosmide

36 clonabile in un cosmide:
Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un cosmide: circa 45 Kb

37 EcoR I Genomic Library Infect cells

38 AAAAAA cDNA synthesis cDNA library Infect cells

39 Genomic Library Construction
Preparing the insert Partial digestion preferred

40 Ligation to vector

41 Genomic library cDNA library Source Variation Insert size
Genomic DNA mRNA Source Species or strains Tissues Developmental stages Variation 12k -- 20k 0.2k -- 6k Insert size Equal Correlate with expression level Representation Only one Expression vs. non expression Type DNA DNA or antibody or protein Probe Gene structure Infer protein identity Encoded protein Purpose

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43 Screening a eukaryotic gene library
Homologous gene from other organism Mammalian genes are very similar Thus if trying to get human gene screen with the equivalent gene from another organism Oligonucleotide based on protein sequence or known sequence of homologous gene Purify protein and determine sequence Build a nucleotide sequence which codes for protein sequence

44 Amino acid sequence Met-Asn-Lys-Trp-Glu-Met Met = ATG; Asn = AAT or AAC; Lys = AAA or AAG; Trp = TGG; Glu = GAA or GAG How many probes must we make? ATG AAT AAA TGG GAA ATG ATG AAT AAA TGG GAG ATG ATG AAT AAG TGG GAA ATG ATG AAT AAG TGG GAG ATG ATG AAC AAA TGG GAA ATG ATG AAC AAA TGG GAG ATG ATG AAC AAG TGG GAA ATG ATG AAC AAG TGG GAG ATG

45 CLONAGGI MULTIPLI

46 VETTORI DI ESPRESSIONE

47 PROTEINE DI FUSIONE

48 PRODUZIONE DI LIBRERIE

49 Screening the Library ATTAGCGCCTTTACGCA ……………………TAATCGCGGAAATGCGT…………

50 Screening with DNA probe
Probe is identified cloned From other organism Same organism Looking for variants Chromosome walk Chromosome walk

51 cDNA library Clone cDNAs
Expression vector Screen for gene of interest based on activity or antibodies

52 Genome Projects Whole genome sequencing Fragment and clone
Sequence ALL clones! Computer assembles

53    Bee             Cat             Chicken             Cow             Dog             Fruit fly    Human    Malaria parasite    Microbial Genomes    Mosquito     Mouse    Nematode    Pig              Plant Genomes Central    Rat    Retroviruses     Sea urchin Tribolium            Sheep             Zebrafish Genome Projects Multiple organisms provide suitable systems for experimentation Zebrafish-development Rat-physiology Dog- genetic disease Fruit fly- behavior Some of practical significance Mosquito/Malaria parasite

54 (o metodo a terminazione di catena)
Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) 1) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da Elevata processività Bassa attività esonucleasica 5’-3’ Bassa attività esonucleasica 3’-5’ (es. Klenow, Sequenasi)

55 (1) Produzione dello stampo a filamento singolo
Utilizzo di fagemidi Utilizzo della PCR Denaturazione del vettore Utilizzo di un fago helper Per M13 e produzione della Forma a singolo filamento

56 (o metodo a terminazione di catena)
Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica ha bisogno di: 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

57 (2,3) Sintesi del filamento marcato
5’-A T C T T T T A G A GT A C C 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ PRIMER DNA Polimerasi 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ DNA Polimerasi PRIMER

58 (o metodo a terminazione di catena)
Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

59 Terminazione della catena
La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

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61 Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno
5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ DNA Polimerasi PRIMER + ddNTP ( per es. ddCTP) 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T AddC STOP Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno in corrispondenza di ogni dCTP ddCTP

62 Schema di sequenziamento a terminazione di catena
DNA stampo a singola elica 3’-GGCTAAC Ibridazione con Il primer 5’ 3’ 3’-GGCTAAC + [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -CC ddG -CCGA ddT -C ddC -CCGATT ddG -CCGAT ddT A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC G T T A G C C Direzione di lettura Sequenza: 5’-CCGATTG

63 Nuovi metodi di sequenziamento
Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica) Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

64 Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica)
DNA stampo PCR con un solo primer ddATP ddA ddA ddA ddA ddA Vengono effettuate 4 rezioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4 dideossi nucleotidi trifosfati. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide

65 Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddT ddC ddG

66 Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le
informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

67 Fluorescent DNA Sequencing
A G T A C T G G G A T C Gel Electrophoresis

68 Detection of Fluorescently Tagged DNA
DNA Fragments Separated by Electrophoresis Optical Detection System Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Output to Computer

69 Fluorescent DNA Sequencing Data

70 Fluorescent DNA Sequence Trace

71 Size of gene library N = ln(1-P) ln (1-A/B) N = Number of clones
P = 95 % probability of finding gene A = Average size of DNA fragments B = Total size of genome E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides Average size of insert is 10,000 nucleotides Number of clones for 95 % probability is 1700

72 Size of gene library If genome is large e.g. human genome (3 x 109) then number of clones to make library becomes unrealistic ( ) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed) Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA I.e. if each vector contains a large piece of DNA you don’t need so many clones to make a gene library

73 What vectors for what libraries?
Human library requires >1,000,000 plasmid clones Human library requires YAC clones

74 YAC=yeast artificial chromosome
Vettori e clonaggio YAC=yeast artificial chromosome

75 Dimostrazione sperimentale degli elementi funzionali di un cromosoma
Vettori e clonaggio Dimostrazione sperimentale degli elementi funzionali di un cromosoma

76 Vettori e clonaggio Vettore YAC: sequenze ARS CEN TEL

77 Vettori e clonaggio

78 Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb
Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb

79 Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors
Vettori e clonaggio Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors Vector Type Cloned DNA (kb) Plasmid 20 λ phage 25 Cosmid 45 P1 phage 100 BAC (bacterial artificial chromosome) 300 YAC (yeast artificial chromosome) 1000

80 Whole Genome Shotgun Celera Genomics
Fragment and sequence entire genome The entire genome is fragmented into small pieces, with no prior knowledge regarding the order or relationship of the clones to on another prior to sequencing. Assembly of these pieces is done by a computer, by searching for overlapping sequences. Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.

81 Overview of Facts Asserted
2.91 billion base pairs (bp) 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s) less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

82 Structure of the genome

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