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Le basi genetiche delle malattie nascitapubertàetà adulta Anomalie cromosomiche Malattie multifattoriali Malattie monogeniche Analisi del cariotipo: Numero.

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Presentazione sul tema: "Le basi genetiche delle malattie nascitapubertàetà adulta Anomalie cromosomiche Malattie multifattoriali Malattie monogeniche Analisi del cariotipo: Numero."— Transcript della presentazione:

1 Le basi genetiche delle malattie nascitapubertàetà adulta Anomalie cromosomiche Malattie multifattoriali Malattie monogeniche Analisi del cariotipo: Numero e struttura dei cromosomi Analisi molecolare: Ricerca di mutazioni puntiformi

2 ANALISI GENETICA PER LA FIBROSI CISTICA

3 FIBROSI CISTICA MALATTIA AUTOSOMICA RECESSIVA INCIDENZA 1:2500 CAUCASOIDI 1:17000 AFRICANI 1:90000 ASIATICI ITALIA 1:2600-1:3170 FREQUENZA PORTATORI CAUCASOIDI: 1/25 ITALIA: 1/

4 FIBROSI CISTICA MALATTIA AUTOSOMICA RECESSIVA INCIDENZA 1:2500 CAUCASOIDI 1:17000 AFRICANI 1:90000 ASIATICI ITALIA 1:2600-1:3170 FREQUENZA PORTATORI CAUCASOIDI: 1/25 ITALIA: 1/ aa Aa AA AA AA Aa Aa Aa

5 ALTERAZIONI TRASPORTO ELETTROLITICO ALTERAZIONE DELLE SECREZIONI MUCOSE INFEZIONE INFIAMMAZIONE ALTI LIVELLI DI Cl- NEL SUDORE SECREZIONI ESOCRINE MUCOSE DENSE ALTERAZIONE DI UN CANALE DEL CLORO CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator)

6 SECREZIONI ESOCRINE MUCOSE DENSE MALATTIA POLMONARE CRONICA OSTRUTTIVA INSUFFICIENZA PANCREATICA ESOCRINA EPATOPATIA DIABETE AZOOSPERMIA DA ATRESIA BILATERALE CONGENITA VASI DEFERENTI (CBAVD) ILEO DA MECONIO ALLA NASCITA

7

8 CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator

9 Struttura del gene CFTR Il gene è presente sul braccio lungo del cromosoma 7 E formato da 250 kb e 27 esoni

10 Proteina CFTR Costituita da: - 6 TMD - 2 ATP binding-cassette - una regione citoplasmatica centrale (R) con funzione regolatoria Formata da 1480 aminoacidi Sintetizzata sul RER e glicosilata nellapparato di Golgi Espressa come proteina integrale di membrana nella parte apicale delle cellule epiteliali dellintestino, delle vie aeree e delle ghiandole sudoripare, vasi deferenti

11 Funzioni di CFTR Attiva il canale per il cloro tramite la fosforilazione del dominio R Stimola ORCC (Outwardly Rectifying Chloride Channel) a secernere cloro Inibisce EnaC (canale del Na+ epiteliale) riducendo il riassorbimento di sodio Regola il PH Membrana plasmaticaLisosomi e apparato di Golgi

12 mutazioni diverse MUTAZIONI NEL GENE CFTR

13 Mutazioni CFTR Severe mutations –F508del –R117H + 5T in cis –I148T del6? Mild mutations –R117H –I148T? Mutations of unknown significance Effetto sul fenotipo:

14 FIBROSI CISTICA CLASSICA < 1% CFTR FIBROSI CISTICA CON 5% CFTR SUFFICIENZA PANCREATICA FORME ATIPICHE 10% CFTR CORRELAZIONE GENOTIPO FENOTIPO

15 La diagnosi di malattia si basa sulla presenza di manifestazioni cliniche o biochimiche compatibili in associazione alla positività di almeno uno tra i test diagnostici validati. 1- il test del sudore (Cloro e Sodio sono aumentati nel sudore degli affetti) 2- lo studio della differenza di potenziale elettrico transepiteliale a livello delle mucose respiratorie o intestinali 3- lanalisi genetica. Per positività allanalisi genetica si intende lidentificazione di due mutazioni note per causare malattia DIAGNOSI

16 DIAGNOSI CF -TEST DEL SUDORE Cl- NA+ CF>60 mmol/l normale<40 mmol/l bordeline mmol/l -TEST DELLA DIFFERENZA DI POTENZIALE ELETTRICO TRANSEPITELIALE DELLE MUCOSE RESPIRATORIO E INTESTINALI CF> 35mV normale < 20mV - TEST GENETICO 2 MUTAZIONI CF

17 TEST GENETICO INDIVIDUI CON SINTOMI CLINICI DI FC CONFERMA DI DIAGNOSI IDENTIFICAZIONE DELLE MUTAZIONI DEL PAZIENTE

18 DIAGNOSI GENETICA CF ANALISI DI I LIVELLO Proposta di Linee guida: Castellani et al RICERCA DELLE MUTAZIONI PIU FREQUENTI NELLA POPOLAZIONE

19 F508del51,07 N1303K4,84 G542X 4, AA->G2,66 R1162X 2, G->A2,11 W1282X1,23 R553X1,15 T338I0,69 R347P 0, G->A0,57 G85E0, G->T0,39 R334W0,30 R352Q0,24 S549N0,24 R347H0,18 L1077P0,16 R1158X0,16 541del C0,16 R1066H0,16 E585X0,16 Q552X0,14 D1152H0, A -> G0, del TG0, ins 40,11 I507del 0, A->G0,10 G1244E0, del G0,10 FREQUENZA CUMULATIVA % 75,69 MUTAZIONI CF IN ITALIA (Analisi di 3492 alleli) Mutazione%

20 F508: Mutazione CFTR più frequente IleIlePheGlyVal ATCATCTTTGGTGTT ATCAT- - -TGGTGTT 3 bp delezione codone 508 (esone 10) Delezione di una Phe, ma viene conservato reading frame

21 La mutazione deltaF508 è presente in tutti i Paesi del continente. La sua frequenza varia notevolmente nelle diverse popolazioni: dal 50% degli alleli FC nellEuropa meridionale al 80% circa nelle popolazioni del Nord Europa, secondo un gradiente di frequenza decrescente da Nord verso Sud-Est.

22 -Test di I livello: ricerca delle mutazioni più frequenti nella popolazione. Consentono, quindi, lidentificazione di mutazioni note. In Italia utilizzando i kit commerciali che includano una trentina di mutazioni si ha una detection rate di circa il 75%. In queste condizioni entrambe le mutazioni possono essere identificate, e quindi consentire la diagnosi, solo in poco più della metà degli affetti; nel 37% dei casi verrà individuato un solo allele malato, addirittura nessuno in 6 affetti su 100. In realtà locali favorite da una distribuzione allelica più omogenea, e dove si possa giungere con unanalisi genetica di I livello ad una copertura del 90%, nel 18% dei pazienti verrebbe comunque identificata una sola mutazione, nessuna in un malato su 100. Pertanto, la sensibilità diagnostica di questo tipo di analisi è limitata. DIAGNOSI GENETICA CF

23 METODI DI TIPIZZAZIONE MUTAZIONI NOTE –presenza/assenza di un sito di restrizione –ARMS –ASO –OLA –Primer Extension (PEX)

24 Test di II livello: scanning del gene volto a individuare variazioni di sequenza in definite porzioni codificanti e nelle regioni di splicing del gene CFTR. Permettono una miglior detection rate. Il risultato può essere di difficile interpretazione in quanto si possono individuare sia mutazioni causanti malattia che varianti fenotipicamente non patologiche (difficile precisare se si tratti di una mutazione o di una variante normale). DIAGNOSI GENETICA CF

25 METODI DI SCANNING: ricerca di tutte le possibili mutazioni presenti in un frammento di DNA. – sequenziamento automatico – SSCP (single strand conformation polymorphism) – DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) – CCM (chemical cleavage of mismatch) – DHPLC ( denaturing high pressure liquid chromatography)

26 Analisi di III livello: ricerca di riarrangiamenti genomici (inserzioni o delezioni nel gene CFTR). In circa il 10-15% dei soggetti affetti, dopo analisi di tutte le porzioni codificanti e regioni di splicing del gene, non si riesce ad identificare la/e mutazioni responsabili della malattia. Una ricerca estesa di riarrangiamenti in una popolazione selezionata ha consentito di individuare 16% di alleli precedentemente non identificati (Audrezet 2004). Studi preliminari su popolazione italiana sembrano confermare il dato, e sottolineare lopportunità di considerare, in casi selezionati, questo tipo di analisi. DIAGNOSI GENETICA CF

27 Audrezet 2004

28 Possono comunque esistere forme classiche di fibrosi cistica nelle quali, anche dopo unanalisi di III livello, non viene individuato un genotipo CFTR compatibile. Si tratta di situazioni rare, che hanno fatto ipotizzare che anche in fibrosi cistica possa essere presente il fenomeno delleterogeneità genetica di locus, e che sottolineano come la diagnosi di malattia sia prevalentemente clinica (Groman 2003). DIAGNOSI GENETICA CF

29 Queste considerazioni sulluso dellanalisi genetica per la diagnosi di fibrosi cistica si applicano alle forme classiche di malattia. Nella forme atipiche è possibile seguire un percorso analogo, rammentando che le mutazioni presenti in questi casi sono spesso diverse da quelle classiche, rappresentate nei kit convenzionali, per cui unanalisi di I livello ha sensibilità ancora minori, e che un approfondimento con scanning del gene trova spesso una specifica indicazione in questo contesto. DIAGNOSI GENETICA CF

30 E preferibile utilizzare lanalisi diretta delle mutazioni presenti nella famiglia. E quindi giustificato, quando vi sia un progetto di gravidanza, indagare il nucleo familiare con ogni livello di analisi che possa consentire lidentificazione del genotipo completo. In alternativa, analisi di linkage con marcatori genetici DIAGNOSI PRENATALE

31 SCREENING NEONATALE Primo livello: dosaggio in tutti i neonati del tripsinogeno immunoreattivo (IRT). Secondo livello: analisi molecolare, basata su un pannello di mutazioni più rappresentate localmente. Viene eseguita nei neonati con alti valori di IRT, abitualmente superiori al 98° centile. La presenza di due mutazioni consente di porre diagnosi di malattia Terzo livello: test del sudore, qualora si individui una sola mutazione

32 Un effetto collaterale è lindividuazione di portatori (IRT positivo, una mutazione, test del sudore negativo) Alcuni di questi neonati sono eterozigoti composti per seconde, rare, mutazioni, e, pur negativi al test del sudore, possono risultare affetti da forme atipiche di fibrosi cistica, o comunque da patologie correlata ad anomalie del gene CFTR. Per questo, come anche per le incertezze che la comunicazione in epoca neonatale su tali mal definite patologie possono suscitare, è indicato analizzare nel secondo step dello screening neonatale solamente mutazioni note per causare forme classiche di malattia. Eventuali approfondimenti di analisi genetica vanno riservati a casi mirati, di difficile definizione diagnostica (ipertripsinemia persistente, test del sudore dubbio). SCREENINING NEONATALE

33 DIAGNOSI DI ETEROZIGOSI Il test genetico può essere richiesto da individui della popolazione generale, con rischio standard di eterozigosi (1/27). Lanalisi genetica indicata è quella di I livello. In caso di negatività allanalisi, la probabilità di eterozigosi è intorno allun per cento (1/105). Non è indicato un test di II livello, uneventuale richiesta di approfondimento può essere gestita testando il partner e calcolando il rischio di coppia. Se viceversa il soggetto risultasse portatore, va proposta lanalisi del partner.

34 I familiari di un malato o di un eterozigote hanno una probabilità maggiore di essere portatori. In questo contesto è essenziale conoscere la mutazione che interessa il ramo familiare a cui appartiene chi richiede lanalisi. Al fine di individuare tale mutazione è giustificato, previo informato consenso dellinteressato, approfondire quando necessario con accertamenti di II od eventualmente anche III livello il genotipo dellaffetto o del genitore dellaffetto parente del consultando. DIAGNOSI DI ETEROZIGOSI

35 In breve Analisi di I livello: kit, commerciale o home-made, che includa le più frequenti mutazioni dellarea di riferimento del laboratorio. Analisi di II livello: scanning di tutti gli esoni e regioni limitrofe. Analisi di III livello: ricerca delezioni e/o inserzioni. · Il test del sudore, e non lanalisi genetica, è il goldstandard per la diagnosi di malattia. Se il test del sudore non è eseguibile o risolutivo, unanalisi genetica di I livello, ed eventualmente su giudizio clinico di II o III livello possono essere indicate. · Il testing fetale è da scoraggiare e va sostituito con la ricerca di mutazioni sulla coppia · Lutilizzo di analisi genetica di I livello può essere integrato nello screening neonatale di malattia. · La probabilità individuale di eterozigosi può essere efficacemente calcolata con un test di I livello, o, in caso di familiarità, con ricerca della mutazione specifica. Non è indicato un test di II livello. · Il rischio riproduttivo di coppia è di solito significativamente ridotto dai test di I livello. Lapprofondimento con test di II livello è possibile in una minoranza di casi, e deve sempre essere preventivamente discusso con la coppia in sede di consulenza genetica.

36 COREA DI HUNTINGTON

37 -Autosomica Dominante - Penetranza dipendente dalletà - 50% si ammalano entro 45 anni

38 HUNTINGTONINA

39 COREA DI HUNTINGTON

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42 Le malattie da espansioni poliglutaminiche

43 COREA DI HUNTINGTON Correlazione tra eta di insorgenza e numero di ripetizioni

44 COREA DI HUNTINGTON: anticipazione

45 DIAGNOSI PREDITTIVA PROBLEMI ETICI

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47 PRINCIPI GENERALI - Consenso Informato - Scelta Informata - Autonomia - Confidenzialità

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49 Diagnosi delle sindromi da espansioni poliglutaminiche con la PCR Alleli normali Alleli mutanti


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