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Microscopi e tecniche Microscopiche 2 parte. TaglioTaglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10mm. MontaggioMontaggio.

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Presentazione sul tema: "Microscopi e tecniche Microscopiche 2 parte. TaglioTaglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10mm. MontaggioMontaggio."— Transcript della presentazione:

1 Microscopi e tecniche Microscopiche 2 parte

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3 TaglioTaglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10mm. MontaggioMontaggio delle sezioni su vetrini per microscopia. Sezione non colorata

4 Tagliare fettine così sottili di campioni biologici di diversa consistenza può essere problematico -Ecco perché occorre INCLUDERE -Esistono diversi mezzi di inclusione che conferiscono diversa consistenza ai campioni. PARAFFINA RESINA MIX DI PARAFFINA E RESINE

5 ColorazioneColorazione delle sezioni con il metodo più appropriato. –I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo. Colorazione automatizzata

6 Colorazioni ColorazioneColorazione con un colore brillante di certe componenti del tessuto Contro colorazioneContro colorazione del resto del tessuto con un colore contrastante

7 Ematossilina/Eosina EmatossilinaEmatossilina ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine). EosinaEosina ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol).

8 Perchè questa "slide" è blu … blu/porpora basofilaSe una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila ematossilinaÈ colorata dall' ematossilina NucleiribosomiNuclei e ribosomi generalmente sono basofili

9 … e questa rossa ? rosso /arancio /rosa acidofila o eosinofilaSe una porzione si colora in rosso /arancio /rosa, viene detta acidofila o eosinofila eosinaÈ colorata dall' eosina Sono proteine del citosol

10 Altre colorazioni PASPAS –Per sostanze ricche in zuccheri (muco) TricromicaTricromica (Azan Mallory) * –Per i tessuti connettivi –Le fibre si colorano in blu Con E&E sono rosa. Le aree bianche sono lipidi Adiposo Bianco

11 Osmio o Sudan blackOsmio o Sudan black –Per grasso /lipidi/mielina –I lipidi non incorporano coloranti acquosi Argento ed oroArgento ed oro –Per fibre delicate e processi cellulari GiemsaGiemsa –Per le cellule del sangue –Simile ad E&E Mielina Cellule nervose Cellule del sangue

12 Come si osserva il campione? Attraverso un buon microscopio ottico Fotografandolo Misurandolo Per avere un'idea delle dimensioni delle strutture osservate si può usare come riferimento un eritrocita ( ˜ 8 micron)

13 Interpretate il campione!!! 3 dimensioniDovete pensare in 3 dimensioni Sezioni serialiSezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione

14 Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali

15 Microscopia Elettronica a Trasmissione Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta –Alta risoluzione Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi Gli elettroni passano attraverso il campione

16 MICROSCOPIA ELETTRONICA Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) limite di risoluzione di questo strumento è di 0,2 nm Un fascio di elettroni attraversa il campione e viene proiettato su uno schermo che trasforma in toni di grigio il numero di elettroni da cui viene colpito. Condensatore e obiettivo non sono costituiti da lenti, ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare le traiettorie degli elettroni verso l'asse.

17 La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico Risoluzione dell'occhio Risoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µm Risoluzione del MO Risoluzione del MO: 2,000 Angstroms = 200nm Risoluzione del TEM Risoluzione del TEM: 2 Angstroms 1 mm = 1000 µm 1 µm = 1000 nm 1 nm = 10 Angstroms Pinocitosi

18 -I campioni devono essere molto più sottili di quelli per il microscopio ottico a luce trasmessa -Non vengono usati coloranti ma sostanze dense agli elettroni semplicemente per dare contrasto o anche per marcare anticorpi Microscopia elettronica

19 Preparatione del campione Fissazione glutaraldeide Tetrossido osmio Deidratazione etanolo (passaggi) Inclusione Resine plastiche Taglio ultramicrotomo (spessore nm) Colorazione Metalli pesanti Cellula eucariotica Nucleo interfasico

20 Preparazione di Campioni Biologici per TEM 1 Acquisizione1 Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm 3 ) Fissaggio2 Fissaggio del campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio –L’osmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri) –Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari.

21 Disidratazione Disidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo. Inclusione Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina.

22 Taglio ultra-microtomo Taglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro). –La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm. –Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito nm).

23 Montaggio delle sezioni Montaggio delle sezioni su di una griglia. Colorazione Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo. Visualizzazione al TEM Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

24 Vari tipi di Microscopia Elettronica Transmissione (TEM)Transmissione (TEM) Scansione (SEM)Scansione (SEM) Shadow-castingShadow-casting Freeze-fractureFreeze-fracture Freeze-etchingFreeze-etching CryoEMCryoEM Negative StainingNegative Staining

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26 Microscopia Elettronica a Scansione SEM fa una scansione della superfice del campioneSEM fa una scansione della superfice del campione Produce immagini 3-DProduce immagini 3-D

27 IL MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM) Nel SEM (ed in genere nella microscopia elettronica) viene sfruttata l’interazione di un fascio di e- con il campione per ricavare informazioni sul campione stesso come nel microscopio luce a riflessione viene utilizzato un fascio di fotoni

28 Non vengono registrati gli e- che attraversano il campione bensì quelli secondari che sono emessi a seguito dell’urto del fascio di elettroni contro di esso

29 Tridimensionalità La caratteristica preminente delle immagini ottenute con il SEM è l’eccezionale tridimensionalità - Ciglia e microvilli

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31 Glomerulo renale

32 Preparazione dei campioni per SEM Acquisizione del campioneAcquisizione del campione –Trattandolo con cura in modo da non danneggiare la superficie Fissazione e disidratazioneFissazione e disidratazione Non si includeNon si include

33 Poggiato su di un supporto e ricoperto con um metalloPoggiato su di un supporto e ricoperto con um metallo –Oro, cromo, palladio, carbone –Deve essere elettron-conducente (non elettrondenso) Visualizzato al microscopioVisualizzato al microscopio FotografatoFotografato Si possono analizzare le componenti chimiche tramite raggi XSi possono analizzare le componenti chimiche tramite raggi X


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