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Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2)

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1 Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35 S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

2 La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’ Terminazione della catena

3 DNA stampo a singola elica 3’-GGCTAAC 5’3’ Ibridazione con Il primer + [ 35 S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -C ddC -CC ddG -CCGATT ddG -CCGA ddT -CCGAT ddT Sequenza: 5’-CCGATTG A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC GTGT T A G C C Schema di sequenziamento a terminazione di catena Direzione di lettura

4 Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddC ddT ddG

5 Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

6 Fluorescent DNA Sequencing A G T A C T G G G A T C Gel Electrophoresis

7 Detection of Fluorescently Tagged DNA DNA Fragments Separated by Electrophoresis Output to Computer Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Optical Detection System

8 Fluorescent DNA Sequencing Data

9 Fluorescent DNA Sequence Trace

10 Overview of Facts Asserted 2.91 billion base pairs (bp) 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s) less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

11 Structure of the genome


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