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1° ESERCITAZIONE: lisi dei batteri  Preparare il Buffer di lisi aggiungendo NaCl e Tris pH 8.0 alla soluzione fornita seguendo la tabella per le concentrazioni.

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Presentazione sul tema: "1° ESERCITAZIONE: lisi dei batteri  Preparare il Buffer di lisi aggiungendo NaCl e Tris pH 8.0 alla soluzione fornita seguendo la tabella per le concentrazioni."— Transcript della presentazione:

1 1° ESERCITAZIONE: lisi dei batteri  Preparare il Buffer di lisi aggiungendo NaCl e Tris pH 8.0 alla soluzione fornita seguendo la tabella per le concentrazioni (Volume finale 1,5 ml) Concentrazione InizialeConcentrazione Finale NaCl5M150mM Tris pH 8.01M50mM  Aggiungere freschi al Buffer di lisi il Cocktail di Inibitori delle Proteasi (250X)  Risospendere il pellet batterico fornito con 1,5 ml di Buffer di lisi  Aggiungere al pellet risospeso il Lisozima (250X)  Incubare in ghiaccio per 20 minuti  Congelare il lisato batterico X J Y Z proteina Lisato batterico GST

2 2° ESERCITAZIONE: preparazione della proteina di fusione Protocollo 1  Scongelare il lisato batterico  Prelevare 1 ml di lisato e aggiungerlo alla resina fornita  Incubare 20 minuti in ghiaccio  Centrifugare 4 minuti a 2500 rpm  Eliminare il supernatante  Effettuare 3 lavaggi con 1 ml di PBS1X, centrifugando 4 minuti a 2500 rpm  Risospendere la resina in 300 μl di PBS1X Protocollo 2: calcolo della concentrazione della proteina di fusione  Prelevare 1 μl di proteina di fusione e diluirlo in 1 ml di soluzione di Bradford  Leggere allo spettrofotometro  Calcolare la concentrazione della proteina proteina GST Resina

3 3° ESERCITAZIONE: controllo della proteina di fusione su gel Protocollo  Prelevare 2 μg di proteina  Risospendere in Buffer di caricamento (3X)  Caricare su gel di poliacrilammide KDa Gruppi MM PTP GST


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