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TECNICHE DI GENETICA MOLECOLARE. Tecnologie di base Polymerase Chain Reaction (PCR) Sequenziamento del DNA Endonucleasidi restrizione Ibridazione di acidi.

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1 TECNICHE DI GENETICA MOLECOLARE

2 Tecnologie di base Polymerase Chain Reaction (PCR) Sequenziamento del DNA Endonucleasidi restrizione Ibridazione di acidi nucleici

3 Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993) specifica sequenzaServe per ottenere una grande quantita’ di una specifica sequenza di DNA in vitro Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte PCR: reazione polimerasica a catena

4 ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE: 1- DNA stampo che contenga la regione da amplificare 2- Due oligonucleotidi complementari a due regioni che si trovano su filamenti opposti del DNA stampo ai lati della regione che si vuole amplificare 3- Polimerasi termostabile (non viene denaturata se portata a 95°C) 4- I 4 desossinucleotidi trifosfati

5 IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI Denaturazione 1- Denaturazione Il DNA stampo viene denaturato, i due filamenti si separano 95°C Appaiamento 2- Appaiamento I Primers si appaiano con il DNA stampo 55°-65°C Sintesi 3- Sintesi E’ ottimale per il funzionamento della TAQ polimerasi 72°C

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7 PCR: amplificazione numero cicli numero sequenze bersaglio sequenza bersaglio La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers

8 RT-PCR PCR rivelazione di uno specifico mRNA …………….. RT-PCR Estrazione dell’RNA Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ mRNA cDNA

9 RETROTRASCRIZIONE 3’ PRIMER mRNA cDNA AAAAA SPECIFIC PRIMING OLIGO dT PRIMING RANDOMPRIMING mRNA cDNA AAAAA TTTTT mRNA cDNA AAAAA

10 AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ mRNA cDNA Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di innesco specifici 5’ 3’ Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi) TTTTTTTT 5’ 3’ 5’ 3’ AAAAAAAA 3’ 5’ PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA: PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR)

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12 ELETTROFORESI Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un campo elettrico applicato SEPARAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA IN BASE ALLE LORO DIMENSIONI I frammenti più piccoli migrano più velocemente rispetto a quelli più grandi. Dopo la corsa elettroforetica i campioni di DNA vengono visualizzati ad un transilluminatore UV come bande fluorescenti mediante l’utilizzo di etidio bromuro, una sostanza fluorescente che si intercala nell’acido nucleico.

13 La velocità di migrazione dipende dalle dimensioni del frammento di acido nucleico Le molecole più grandi incontrano maggior resistenza nelle maglie del gel rispetto alle molecole di dimensioni più piccole Molecole più piccole migrano più velocemente Molecole più grandi migrano più lentamente

14 ELETTROFORESI CAPILLARE Migrazione dei campioni all’interno di un capillare Strumenti automatizzati per l’analisi di frammenti e l’analisi di sequenze Utilizzo per l’amplificazione di un primer fluorescente Vantaggi Velocità di corsa Analisi di ridotte quantità di campione Alto potere risolutivo

15 VANTAGGI DELLA PCR SENSIBILITA’ Si possono amplificare regioni specifiche di DNA avendo a disposizione pochissimo materiale di partenzaVELOCITA’ In poche ore è possibile l’amplificazione del frammento desiderato

16 LIMITI DELLA PCR SENSIBILITA’ La tecnica è suscettibile di contaminazioni da parte dell’operatore o da parte di precedenti prodotti di amplificazione NECESSITA’ DI NOZIONI A PRIORI E’ necessario avere informazioni precise sulla sequenza da amplificare DIMENSIONE DEI PRODOTTI DI AMPLIFICAZIONE In condizioni standard i prodotti della PCR non possono superare le 5000 paia di basi

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18 SEQUENZIAMENTO DIRETTO

19 Il sequenziamento degli acidi nucleici è il miglior modo per ottenere informazioni precise e definitive su un gene o una sua parte SEQUENZIAMENTO DIRETTO

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21 Il metodo di Sanger si basa sul meccanismo della replicazione del DNA P P P P T G A T C P A P G P A ELICA STAMPO P A P P ELICA NEOSINTETIZZATA

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26 A C G T

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28 ELETTROFEROGRAMMA

29 SOSTITUZIONE C->T PRESENZA DI UN DOPPIO PICCO Wild-type FORWARD REVERSE Mutato MUTAZIONE ETEROZIGOTE

30 Dal punto mutato si sovrappongono due diverse sequenze

31 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE

32 Enzimi che tagliano il DNA in tutti i punti che contengono una piccola e specifica sequenza di riconoscimento lunga solitamente 4-8 nucleotidi palindrome Le sequenze di riconoscimento per la maggior parte delle nucleasi di restrizione sono normalmente palindrome (la sequenza di basi è identica su entrambi i filamenti quando ciascuno di essi venga letto in direzione 5’->3’)

33 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE -Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti -Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi). EcoRI EcoRIE = genere Escherichia co =specie coli G/AATTC R =ceppo RY13 CTTAA/G I =prima endonucleasi isolata BamHI BamHIB = genere Bacillus am = specie amylolique faciensG/GATCC H = ceppo HCCTAG/G I = prima endonucleasi isolata

34 5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ 5’ GGCC 3’ 3’ CCGG 5 BLUNT HaeIII BamHI 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ EcoRI 5’-PROTRUDING 5’ GCGC 3’ 3’ CGCG 5 HhaI 3’-PROTRUDING Il taglio del DNA è perfettamente simmetrico e genera frammenti con estremità piatte. Possono formare legami idrogeno tra le due code a filamento singolo complementari. Le estremità coesive facilitano la reazione della DNA ligasi.

35 Alleli WT,WT MUT,MUT WT,MUT ALLELE WT ALLELE MUT ab Valutazione della presenza della mutazione 191C>T (Q33X) nel gene TREM2 in una famiglia con una forma di demenza precoce a trasmissione autosomica recessiva. MarkerMarker La mutazione abolisce il sito di taglio per l’enzima PstI

36 ALLELE MUT ALLELE WT ab Alleli WT,WT MUT,MUT WT,MUT Valutazione della presenza della mutazione 1216C>T nell’esone 12 del gene NF2 in una famiglia con neurofibromatosi di tipo 2 (autosomica dominante). La mutazione inserisce il sito di taglio per l’enzima PstI.

37 IBRIDAZIONE ACIDI NUCLEICI

38 IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Ibridazione: appaiamento di 2 molecole di DNA o RNA complementari Complementarieta’: una sequenza nucleotidica S e’ la complementare di S’ se i due filamenti possono appaiarsi secondo la regola di Watson e Crick

39 La denaturazione non è un processo irreversibile. Infatti se dopo la separazione delle eliche si fa scendere gradualmente la temperatura, le singole eliche complementari si possono riappaiare e la doppia elica può riformarsi. Questo processo si chiama ibridazione.

40 Specifica sequenza di DNA marcato capace di legarsi ad una sequenza complementare presente sul cromosoma

41 ~ 16 ore SOLUZIONE ALCALINA Trasferimento Filtro di nitrocellulosa Ibridazione con la sonda specifica la sonda specifica Gel Gel Nitrocellulosa Spugna Carta assorbente La membrana viene quindi separata dal gel e immersa in una soluzione contenente la specifica sonda marcata che ibriderà soltanto con le sequenze complementari presenti sul filtro permettendo la loro identificazione. Il Southern blot permette di rivelare la presenza di specifiche sequenze di DNA in una miscela complessa di acidi nucleici. DNA digerito con endonucleasi di restrizione e sottoposto ad elettroforesi su gel d’agarosio. La denaturazione dell’acido nucleico serve per ottenere frammenti a singola elica e permettere la successiva ibridazione con una sonda Per capillarità, la soluzione tenderà ad attraversare il gel e la membrana risalendo verso i fogli assorbenti. I sali disciolti nella soluzione trascinano i segmenti di DNA in verticale, depositandoli sullo strato del supporto solido con il quale instaurano legami elettrostatici.

42 SOUTHERN BLOT Permette di evidenziare difetti molecolari quali delezioni e riarrangiamenti genici Il bersaglio è il DNA genomico NORTHERN BLOT Permette di stabilire il pattern di espressione del gene d’interesse Il bersaglio è costituito dall’RNA

43 Il “Northern blot” è una tecnica usata per determinare in quale tessuto o tipo cellulare è espresso un gene, ed anche la lunghezza e la quantità di mRNA. I livelli di mRNA sono spesso correlati ai livelli di proteina presente nel tessuto.

44 DIAGNOSI MOLECOLARE DI MALATTIE GENETICHE

45 TEST GENETICI CAMPIONI BIOLOGICI Sangue periferico Bulbi piliferi Mucosa orale Fibroblasti cutanei Cellule fetali –Amniociti –Villi coriali –Sangue di cordone ombelicale Ecc. ecc.

46 Ritardo mentale Anomalie congenite multiple Limite di risoluzione: 4 Mb INDAGINI CITOGENETICHE ANALISI CHE CONSENTONO LO STUDIO DELL’ASSETTO CROMOSOMICO DELLE CELLULE E QUINDI IL CARIOTIPO

47 DIAGNOSIMOLECOLARE

48 DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA INDIRETTA DIRETTA DIRETTA

49 DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA ANALISI DI LINKAGE difetto molecolarenonnoto tempi ragionevoli Si adotta qualora il difetto molecolare non sia noto oppure non sia possibile identificare la mutazione in tempi ragionevoli marcatori associati alla malattia segregazione Vengono utilizzati dei marcatori associati alla malattia e ne viene seguita la segregazione all’interno della famiglia.

50 MARCATORE GENETICOlocus genico che identifica univocamente una regione cromosomica MAPPA GENETICAdefinisce le relazioni lineari tra i marcatori molecolari STABILE NELLE GENERAZIONI POLIMORFICO deve possedere almeno 2 alleli allele più raro deve avere una frequenza di almeno 1% nella popolazione FACILMENTE IDENTIFICABILE SEGREGAZIONE MENDELIANO PRESENTE IN QUALSIASI TESSUTO RFLPMinisatellitiMicrosatellitiSNP

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54 bp 128 bp

55 (CAG) n CAMPIONE OMOZIGOTE NON INFORMATIVO CAMPIONE ETEROZIGOTE INFORMATIVO HapII -

56 AA aa AaAa AaAaAaAa AaAa Gene A Gene malattia LA DIAGNOSI CONSENTE DI STABILIRE SE IL PROBANDO HA EREDITATO O MENO DAI GENITORI I CROMOSOMI CHE PORTANO LA MUTAZIONE PATOLOGICA

57 DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA Distinguere i due cromosomi del genitore che possono aver trasmesso il gene patologico (si usa un marcatore strettamente associato per il quale essi siano eterozigoti) La malattia dovrebbe essere adeguatamente mappata in modo da usare marcatori associati al locus della malattia Scoprire quale cromosoma sia stato trasmesso al probando AA aa AaAa AaAaAaAa AaAa Gene A Gene malattia

58 DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA ………….LIMITI E’ NECESSARIA L’ANALISI DI DIVERSI MEMBRI DELLA FAMIGLIA AA aa AaAa AaAaAaAa AaAa Gene A Gene malattia

59 EVENTUALI EVENTI RICOMBINATIVI TRA I MARCATORI ED IL GENE RESPONSABILE DELLA PATOLOGIA POSSONO RENDERE I RISULTATI INATTENDIBILI UTILIZZO DI MARCATORI TELOMERICI E CENTROMERICI AL GENE MALATTIA Gene A Gene malattia Gene B DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA ………… LIMITI A malattia a normale Aa Gene A Gene malattia

60 DIAGNOSI MOLECOLARE INDIRETTA INDIRETTA DIRETTA DIRETTA

61 DIAGNOSI MOLECOLARE DIRETTA RICERCATA RILEVATA LA MUTAZIONE RESPONSABILE DI UNA PATOLOGIA VIENE RICERCATA E RILEVATA DIRETTAMENTE SU DNA, RNA O PRODOTTO PROTEICO DEL PROBANDO. SINGOLO SOGGETTO QUESTO TIPO DI DIAGNOSI PUÒ ESSERE ESEGUITA SU UN SINGOLO SOGGETTO

62 TEST GENETICO SUL PROBANDO MUTAZIONE IDENTIFICATA? SINO TEST GENETICO NEI FAMILIARI A RISCHIO ANALISI DEL DNA NON INFORMATIVA NO TEST GENETICO NEI FAMILIARI A RISCHIO PORTATORE NON PORTATORE RICERCA DI MUTAZIONE

63 SCELTA DEL METODO DIAGNOSTICO ETEROGENEITA’ GENETICA DIMENSIONI DEL GENE TIPI DI MUTAZIONE NUMERO DI CAMPIONI DA TESTARE RICERCA DI MUTAZIONI NOTE O IGNOTE

64 ETEROGENEITA’ DI LOCUS MUTAZIONI A LOCI DIVERSI PORTANO ALLA STESSA PATOLOGIA A seconda della localizzazione cromosomica e della funzione dei geni coinvolti, una stessa malattia può avere diversi meccanismi di trasmissione Retinite pigmentosa – 12 forme autosomiche dominanti – 5 forme autosomiche recessive – 3 forme legate all’X ETEROGENEITA’ GENETICA ETEROGENEITA’ ALLELICA PAZIENTI DIVERSI SONO PORTATORI DI MUTAZIONI DIVERSE ALLO STESSO LOCUS

65 ETEROGENEITA’ GENETICA DIMENSIONI DEL GENE DIMENSIONI DEL GENE TIPI DI MUTAZIONE TIPI DI MUTAZIONE NUMERO DI CAMPIONI DA TESTARE NUMERO DI CAMPIONI DA TESTARE RICERCA DI MUTAZIONI NOTE O IGNOTE RICERCA DI MUTAZIONI NOTE O IGNOTE SCELTA DEL METODO DIAGNOSTICO

66 IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE ANALISI DI RESTRIZIONE AMPLIFICAZIONE ALLELE-SPECIFICA ALLELE SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE ASSAY (ASO) OLIGONUCLEOTIDE LIGATION ASSAY (OLA)

67 IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE ANALISI DI RESTRIZIONE RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) Una mutazione con sostituzione di una base può creare o eliminare un sito di restrizione

68 Endonucleasi di restrizione EcoRI non taglierà questa sequenza

69 FAMILIAL MEDITERRANEAN FEVER GENE; MEFV Gene map locus 16p13

70 AMPLIFICAZIONE IN PCR DIGESTIONE ENZIMATICA CONTROLLO DELLE DIMENSIONI DEI PRODOTTI SU GEL NORMALEGTAC TAGLIO CON RsaI MUTATOGTAG PERDE IL SITO RsaI UNCUT GENE NF2 TAC->TAG TYR-221>STOP

71 IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE AMPLIFICAZIONE ALLELE-SPECIFICA ALLELE SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE ASSAY (ASO) OLIGONUCLEOTIDE LIGATION ASSAY (OLA)

72 X TAGCCAGTGACGGTTAGC ATCGGTCACTGCCAATCG TAGCCAGTGACGGTTAGC X TAGCCAGTGACGGTTAGA ATCGGTCACTGCCAATCT TAGCCAGTGACGGTTAGA G ATCGGTCACTGCCAATC T ATCGGTCACTGCCAATC WT ETEROZIGOTE MUTATO WT MUT WT MUT WT MUT C wt A mut Diagnosi di mutazioni amplificazione allele-specifica I primers allele-specifici differiscono per il nucleotide all’estremità 3’del filamento la sintesi dell’amplificato nella reazione di PCR dipende dal corretto appaiamento di questa estremità Per ogni campione vengono allestite due reazioni di PCR utilizzando in ogni reazione il primer comune in combinazione con quello corrispondente rispettivamente alla sequenza normale e a quella mutata

73 Diagnosi di mutazioni ibridazione con sonde allele-specifiche

74 ASO WT ASO MUT Vengono sintetizzate sonde oligonucleotidiche sia per l’allele normale che per quello mutato. Il mismatch corrispondente alla mutazione si trova nella parte centrale dell’oligonucleotide così da massimizzare l’instabilità degli eteroduplex. Il DNA viene fissato su un supporto solido (membrana di nylon o nitrocellulosa), e viene ibridato sia con la sonda corrispondente all’allele normale sia con la sonda corrispondente all’allele mutato. Mutazione in omozigosi: la sonda complementare alla sequenza dell'allele normale non ibrida, Mutazione in eterozigosi: ibridano sia la sonda complementare alla sequenza dell'allele normale sia quella complementare all'allele mutato. In condizioni di ibridazione adeguatamente stringenti sonde sintetiche ibridano solo con la sequenza capace di dare appaiamento perfetto

75 Sonde normali Sonde mutate IBRIDAZIONE WT ETEROZIGOTE OMOZIGOTE ETEROZIGOTE COMPOSTO Reverse dot blot Sul filtro sono fissate le sonde oligonucleotidiche corrispondenti alle forme normali e mutate.  F508 in CFTR gene Normal allele CFTR allele

76 METODI PER IDENTIFICARE LA PRESENZA DI MUTAZIONI IN REGIONI NON DEFINITE DEL GENE

77 Il sequenziamento degli acidi nucleici è il miglior modo per ottenere informazioni precise e definitive su un gene o una sua parte SEQUENZIAMENTO DIRETTO

78 METODI PER IDENTIFICARE LA PRESENZA DI MUTAZIONI IN REGIONI NON DEFINITE DEL GENE METODI DIAGNOSTICI ANALISI DEGLI ETERODUPLEX

79 DENATURAZIONERINATURAZIONE OMODUPLEX WT ETERODUPLEX OMODUPLEX MUT 0 Analisi degli eteroduplex. mutato Si formano quando un frammento amplificato di DNA mutato ed uno di DNA wild- type vengono denaturati termicamente e lasciati ricombinare. ETERODUPLEX ETERODUPLEX combinazione di due catene di DNA a singolo filamento non perfettamente corrispondenti, con presenza di un "rigonfiamento" dove è localizzato il mismatch.

80 DHPLC DHPLC (Denaturing High-Performance Liquid Chromatography)SSCP (Analisi dei Polimorfismi di Conformazione delle Singole Eliche) ANALISI DEGLI ETERODUPLEX Gli eteroduplex hanno profili di denaturazione anomali.

81 È una tecnica per la rilevazione di mutazioni (SNPs, inserzioni, delezioni e tandem repeat) presenti in eterozigosi. Sfrutta la differente velocità di migrazione di eteroduplex e omoduplex, in un mezzo simile ad un gel quale è la colonna HPLC. I duplex si formano quando un frammento amplificato di DNA mutato ed uno non mutato vengono denaturati termicamente e lasciati ricombinare La presenza di picchi aggiuntivi rispetto a quelli attesi dall'eluizione delle sole molecole omoduplici rivela la presenza di una mutazione in eterozigosi. DENATURAZIONERINATURAZIONE DHPLC DENATURING HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY OMODUPLEX WT ETERODUPLEX OMODUPLEX MUT

82 CROMATOGRAMMI DEGLI ESONI 39, 41, 6 E 23 DEL GENE DELLA DISTROFINA IN MASCHI SANI vs MASCHI AFFETTI DA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE

83 SSCP ANALISI DEI POLIMORFISMI DI CONFORMAZIONE DELLE SINGOLE ELICHE La mobilità elettroforetica di una particella in un gel dipende sia dalle sue dimensioni che dalla sua forma In condizioni non denaturanti il DNA a singolo filamento si ripiega in maniera dipendente dalle sue interazioni molecolari, e quindi, dalla sua sequenza. Nell’analisi SSCP una sequenza mutata è evidenziate dalla variazione della sua mobilità elettroforetica (causata dall’alterazione della sua conformazione secondaria) in un gel di poliacrilamide non denaturante DENATURAZIONE E RAPIDO RAFFREDDAMENTO PAGE.. WT MUT

84 Singolo filamento ETERODUPLEX Doppio filamento SSCP SENSIBILITA’ 80% NEL RIVELARE SOSTITUZIONI DI SINGOLE BASI IN FRAMMENTI DI DIMENSIONI INFERIORI A 200 bp

85 EcoRI probe AA AB BB EcoRI probe AA AB BB SOUTHERN BLOT RIARRANGIAMENTI GENOMICI

86 Diagnosi della sindrome da androgeno resistenza per mezzo dell’analisi del Southern blot Il DNA dal gel di agarosio è stato trasferito su nitrocellulosa ed ibridizzato alla sonda cDNA di un recettore androgenetico. Si osservano 3 frammenti genomici nel DNA di entrambi i genitori ma non in quello del figlio. Conclusione: Il gene per il recettore androgenetico (AR) è X-linked. La madre ha solo un gene AR intatto (l’intensità delle bande è simile a quella della padre). Il figlio ha ereditato dalla madre il cromosoma X che ha una delezione nel gene AR.

87 Emocromatosi ereditaria

88 Autosomica recessiva Frequenza dei portatori 1/10 Omozigoti o Eterozigoti composti ~ 1 su 400 Manifestazioni cliniche 5:1 maschi:femmine Età d’insorgenza - > 40anni

89 Patologia da eccessivo deposito di ferro CUTEaumentata pigmentazione PANCREASdiabete ad insorgenza tardiva FEGATOcirrosi, neoplasie CUOREscompenso cardiaco IPOFISIriduzione libido/impotenza Emocromatosi ereditaria

90 C282Y C282Y è la mutazione più frequente nell'emocromatosi. Presente in omozigosi nel 80-90% dei casi nelle popolazioni nord europee, (65% in Italia). ISTIDINA 63 ACIDO ASPARTICO (H63D) Gene map locus 6p21.3

91 Diagnosi biochimica Studio del ferro Ferro sierico Saturazione della transferrina Ferritina sierica Biopsia epatica Accumuli di ferro Test genetico  2 microglobulin s s s s His63Asp Cytosol COOH Cys282Tyr Hfe Protein H63DC282Y Emocromatosi ereditaria

92 Eterozigote Composto H63D C282Y Omozigote C282Y WT

93 FIBROSI CISTICA E’ una delle più comuni malattie monogeniche, trasmessa come carattere autosomico recessivo. La sua incidenza è compresa tra 1/1.600 e 1/3.000 nella maggior parte delle popolazioni occidentali

94 MANIFESTAZIONI CLINICHE Respiratorie: infezioni/infiammazioni delle vie aeree inferiori e dei seni paranasali  malattia ostruttiva e insuff. respiratoria Gastrointestinali: insufficienza pancreatica con malassorbimento (  90%); ileo da meconio nel 10-20% dei neonati; diabete mellito (15%) Nei maschi (>95%): azoospermia ostruttiva da anomalo sviluppo delle strutture di derivazione wolfiana (Assenza Congenita Bilaterale dei Vasi Deferenti: CBAVD)

95 FIBROSI CISTICA Patologia Autosomica Recessiva   Padre Portatore Madre Portatrice Sano 1/4 Portatore 1/2 Malato 1/4

96 GENETICA MOLECOLARE Causata da mutazioni del gene CFTR (“Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator”), localizzato in 7q22 La proteina CFTR è un canale di trasporto ionico disposto a livello della membrana cellulare

97 IL GENE CFTR Struttura 250 kb - 27 esoni mRNA 6.5 kb

98 La gravità delle conseguenze delle mutazioni va progressivamente decrescendo dalla classe I alla classe V. I quadri più gravi di malattia sono associati alla presenza di 2 mutazioni “severe”. Gli eterozigoti composti per una mutazione severa + una lieve hanno manifestazioni più lievi (es. CBAVD isolata)

99 ETEROGENEITÀ ALLELICA NELLA FIBROSI CISTICA Oggi sono conosciute più di mutazioni (la maggior parte è stata identificata in singole famiglie)

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101 Standards and Guidelines for CFTR Mutation Testing American College of Medical Genetics Genetics in Medicine 2002; 4(5): INDICAZIONI AL TEST test diagnostico, possibile diagnosi FC test diagnostico, definire una diagnosi FC test diagnostico, neonati con ileo da meconio test diagnostico, maschi con CBAVD Test per il portatore, partner di soggetti con storia familiare positiva Test per il portatore, parner di maschi con CBAVB Test per il portatore, soggetti con storia familiare positiva Test per il portatore, donatori di gameti Diagnosi preimpianto test per diagnosi prenatale, coppie di portatori sani con un rischio 1/4 test per diagnosi prenatale, iperecogenicità intestinale nel II trimestre di gravidanza Screening neonatale

102 TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE ANALISI DI I LIVELLO L ’analisi genetica di I livello consiste nella ricerca delle mutazioni più frequenti nella popolazione. Le tecniche utilizzate devono soddisfare criteri di sensibilità del sistema,riproducibilità e rapidità, quest ’ultima in funzione del numero sempre maggiore di analisi richieste. Possono essere utilizzate tecniche “home made ” o kit commerciali ANALISI DI II LIVELLO L ’analisi genetica di II livello utilizza sistemi di “scanning ” del gene che permettono il riconoscimento di variazioni della sequenza nelle regioni codificanti e nelle giunzioni introne/esone del gene CFTR

103 ANALISI DI I LIVELLO Reverse Dot Blot (RDB) Oligonucleotide Specific Allele (ASO) Oligonucleotide Ligation Assay (OLA) Detection of  F508 in the cystic fibrosis gene Normal allele CF allele

104 OLA Screening 31 mutazioni MUTAZIONI INVESTIGATE G85EG542X 621+1G  T S549N R117HS549R Y122XG551D 711+1G  T R553X 1078delTR560T R347P G  A R347H 2183AA  G R334W G  A A455ER1162X DI delC DF KbC  T G  A3849+4A  G Q493XW1282X V520F3905insT N1303K

105 SEQUENZIAMENTO DI TUTTO IL GENE ANALISI DI II LIVELLO Il risultato molecolare può essere di difficile interpretazione o Mutazioni causanti malattia o Varianti fenotipicamente non patologiche


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