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PCR quantitativa Real-Time e sue applicazioni in ambito biomedico Laboratorio di Oncoematologia Pediatrica Dott.ssa Virginia Libri.

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Presentazione sul tema: "PCR quantitativa Real-Time e sue applicazioni in ambito biomedico Laboratorio di Oncoematologia Pediatrica Dott.ssa Virginia Libri."— Transcript della presentazione:

1 PCR quantitativa Real-Time e sue applicazioni in ambito biomedico Laboratorio di Oncoematologia Pediatrica Dott.ssa Virginia Libri

2 RT-PCR convenzionale Retrotrascrizione dellRNA in cDNA Retrotrascrizione dellRNA in cDNA Oligo d(T) Random esameri Primer specifico per il gene Amplificazione del cDNA tramite PCR Amplificazione del cDNA tramite PCR Tradizionale reazione multiciclica suddivisa in 3 fasi: Denaturazione,Annealing,Estensione Separazione elettroforetica dei prodotti di PCR (ampliconi) Separazione elettroforetica dei prodotti di PCR (ampliconi) Gli ampliconi sono ottenuti dopo uno specifico numero di cicli di amplificazione Vengono fatti migrare su un gel di agarosio

3 Polymerase Chain Reaction: principio Amplificazione selettiva in vitro di una sequenza di DNA target COMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCR COMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCR: 1)Sequenza di DNA target 2)DNA polimerasi termostabile (Termophilus aquaticus, Taq polimerasi) 3)Due oligonucleotidi (15-25 bp) specifici per la sequenza target 4)dNTPs

4 Polymerase Chain Reaction: principio CICLI TERMICI: DENATURAZIONE(94-96°C) ANNEALING(50-65°C) EXTENSION(72°C)

5 Polymerase Chain Reaction: Multiple PCR Cycles DNA fragment to be amplified 2 copies 4 copies8 copies

6 Polymerase Chain Reaction: vantaggi 1)Velocità e facilità duso In poche ore si possono ottenere milioni di copie della sequenza di DNA target 2)Sensibilità Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una singola cellula come template (contaminazione) 3)Robustezza Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di bassa qualità

7 Polymerase Chain Reaction: svantaggi 1)Solo sequenze note Necessario conoscere la sequenza del DNA da amplificare per sintetizzare i primers 2)Dimensioni e quantità limitate Dimensioni medie dellamplicone 0.1-5kb Quantità limitata rispetto alle tecniche di clonaggio 3)Proofreading Taq polimerasi manca dellattività 3 5 esonucleasica, 20 cicli di reazione su un frammento di 1 kb produrranno 40% di frammenti con una mutazione puntiforme ( 1/10000)

8 Polymerase Chain Reaction: resa Resa teorica: 2 n P=(2) n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n) Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza Log[DNA] N° cicli termici Esponenziale Lineare Plateau Prodotto variabile

9 Polymerase Chain Reaction: plateau Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede allinfinito, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

10 Il plateau non dipende da T Anche se la quantità iniziale di template è la medesima, il plateau è raggiunto in tempi diversi ed in cicli diversi

11 Soluzioni Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale Il prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCR Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCR La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR

12 RT-PCR convenzionale Manual or automated analysis Reverse transcription transcription PCR reaction reaction Nested PCR reaction Gelelectrophoresis DNAsequencing Southern blot Real-time RT-PCR Reversetranscription PCR reaction Quantitative result

13 Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"

14 RT-PCR quantitativa Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR Rilevamento della fluorescenza associata allamplificazioneRilevamento della fluorescenza associata allamplificazione Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosioIl prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computerAnalisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

15 Analisi tramite software

16 La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche. Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time per PCR Real-Time

17 SYBR Green

18 SYBR Green I SYBR Green: principio Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA

19 Allinizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente SYBR Green

20 Dopo lannealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica. SYBR Green

21 Durante lelongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all aumento del numero di copie dellamplicone SYBR Green

22 SYBR green Metodica semplice Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa Non costosa Non-specifica Non-specifica La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici

23 Curva di dissociazione Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione

24 Tm melting peak Curva di dissociazione

25 TaqMan

26 TaqMan La Real-Time PCR si può realizzare mediante limpiego: ( es. SYBR green), che si legano coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano in maniera a tutto il DNA in maniera aspecifica a tutto il DNA, per il frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti Esistono diversi tipi di sonde: Dual-labeled (come le sonde TaqMan) Molecular beacons Scorpion Sonde FRET Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

27 Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare La sonda è disegnata in modo da ibridarsi allinterno del frammento amplificato nella reazione di PCR Primer RQ53

28

29 Dimensione dellamplicone

30

31 Forward Probe Reverse

32 Sonda TaqMan 5 3 Presenta allestremità 5 un fluoroforo Reporter ed allestremità 3 una molecola Quencher

33 Reporter-Quencher DyeQuencher 5,6 FAMBHQ-1/TAMRA HEX/JOEBHQ-2 Texas Red/ROXBHQ-2 Cy5/Quasar670BHQ-2 ( or-3) 6-carbossifluoresceina 6-carbossitetrametilrodamina

34 Reporter-Quencher 5 REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza 3 QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter 53 RQ Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q

35 RQ R Q R Q Real-Time PCR: attività 5>3 esonucleasica

36 Forward primer Reverse primer Probe Laumento di fluorescenza del Reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati

37 Real-Time PCR: la reazione COMPONENTI DELLA REAZIONE: 1)DNA target 2)DNA polimerasi 3)Due oligonucleotidi 4)dNTPs 5)Probe fluorescente

38 50°C 2 min 95°C 3 min 55°C 30 s 65°C 1 min 50 cycles Activates UNG (Uracile N-Glicosilasi) Activates Amplitaq Gold Run Real-Time thermal cycle 15 s

39 Curve di amplificazione Plot lineare Cicli di amplificazione Fluorescenza Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui C T (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di template iniziale

40 Plot di amplificazione PCR cycle number Normalised reporter fluorescence (R n ) E il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold Indica il valore al di sopra del quale inizia laccumulo di un amplificato Linea soglia scelta dalloperatore In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale

41 Quantificazione ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i C T Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve) Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro C T con quello del controllo endogeno

42 Quantitativa assoluta log 10 quantity Ct unknown sample 3500 copies Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso costitutivamente ( -actina, GAPDH, ATPs, 2 etc)

43 Quantitativa relativa Plot di amplificazione Numero di cicli C T Sample Control

44 Quantitativa relativa: analisi dei dati Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente ( C T ) Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente ( C T ) Comparare ciascun C T così ottenuto con il C T di un trattamento di controllo anche detto calibratore (cb) ( C T ) 2 - ( CT,r- CT,cb 2 - CT 2 - ( CT,r- CT,cb ) = 2 - CT Il valore così ottenuto permette di determinare la concentrazione relativa del target Il valore così ottenuto permette di determinare la concentrazione relativa del target

45 Sonde FRET ( F luorescence R esonance E nergy T ransfer ) Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però ognuna marcata con un solo fluorocromo (accettore e donatore) Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però due sonde ognuna marcata con un solo fluorocromo (accettore e donatore) Quando le sonde non sono legate alle sequenze target il segnale fluorescente proveniente dall'accettore non è rilevato Durante lo step di annealing PCR, entrambe le sonde FRET ibridizzano alle sequenze target: ciò avvicina il fluoroforo donatore all'accettore permettendo il trasferimento di energia tra i due fluorofori e la produzione di un segnale fluorescente da parte dell'accettore che viene rilevato donatore accettore

46 Molecular Beacons I "molecular beacons" contengono un fluoroforo e un quencher non fluorescente alle estremità opposte di un oligonucleotide, che sono disegnate in modo da essere complementari tra loro formando una struttura stem-loop Il loop è complementare ad una sequenza all'interno del prodotto amplificato fluoroforo quencher La vicinanza del quencher al reporter fluorescente impedisce lemissione di fluorescenza

47 Molecular Beacons Durante lo step di annealing PCR, la sonda ibridizza alla sua sequenza target: ciò separa il colorante fluorescente dal reporter, producendo un segnale fluorescente La quantità di fluorescenza prodotta ad ogni ciclo, o dopo la PCR, dipende dalla quantità di prodotto specifico in quel dato momento A differenza delle sonde TaqMan, le molecular beacons non vengono distrutte durante durante la reazione di amplificazione per vengono distrutte durante durante la reazione di amplificazione per cui possono reibridizzarsi durante il successivo ciclo Amplicon FRET EXCITATIONE ANNEALING

48 Probes : Scorpions La progettazione delle scorpion probes è simile a quella delle molecular probes, con la differenza che al 3 terminale del probe La progettazione delle scorpion probes è simile a quella delle molecular probes, con la differenza che al 3 terminale del probe vi è una sequenza, PCR primer, che è specifica per l estensione del target Questa sequenza è legata al 5 terminale di un primer per mezzo di un blocker 3 5

49 Probes : Scorpions Step 1 Lo Scorpions primer è esteso su un target di DNA Scorpions primer Probe Target di DNA

50 Step 2 Durante il processo di denaturazione si verifica lallontanamento del quencher dal reporter e del primer di innesco dal DNA target Probes : Scorpions Q R Primer di innesco DNA target

51 Step 3 Raffreddandosi lo Scorpion esteso subisce un riarrangiamento interno ed emette fluorescenza in maniera target specifica. Un primer non esteso viene quenciato Probes : Scorpions

52 Riassumendo : Metodi di rilevamento della fluorescenza SYBR Green TaqMan Molecular Beacons Scorpion probe

53 Real-Time PCR: applicazioni Quantificazione virale Quantificazione dellespressione genica Efficacia della terapia farmacologica Misura dei danni al DNA Controllo di qualità e validazione dei saggi Detenzione dei patogeni Controllo degli OGM Genotyping MRD MRD

54 Tali elementi neoplastici, presenti ad un livello inferiore alla capacità di rilevazione delle metodiche convenzionali, sono in grado di espandersi e dare origine alla recidiva Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche MRD (Minimal Residual Disease):

55 TH (Tirosina Idrossilasi) Enzima che catalizza la prima reazione di biosintesi delle catecolamine

56 HVA-VMA

57 TH (Tirosina Idrossilasi) Perché la scelta di studiare lespressione della TH? Le cellule di Neuroblastoma (NB) hanno la caratteristica di sintetizzare catecolamine, che risultano alterate nel 95% dei pazienti. La TH è uno dei marker tumorali tessuto-specifici espresso dalle cellule di NB,ma non dagli altri tumori a piccole cellule rotonde Pertanto lo studio di questo enzima può essere utilizzato per identificare le metastasi midollari al momento della diagnosi e per monitorare lo stato della MRD in modo da individuare eventuali segnali precoci di ricaduta in pazienti in remissione clinica Pertanto lo studio di questo enzima può essere utilizzato per identificare le metastasi midollari al momento della diagnosi e per monitorare lo stato della MRD in modo da individuare eventuali segnali precoci di ricaduta in pazienti in remissione clinica

58 TH (Tirosina Idrossilasi) Possibile ruolo della TH come fattore prognostico negativo nel Neuroblastoma (. Possibile ruolo della TH come fattore prognostico negativo nel Neuroblastoma (Pession et al. Oncology Reports 10: ,2003) La concordanza con le analisi diagnostiche standard evidenziata nello stadio IV consente di considerare la TH quale utile parametro predittivo alla diagnosi La concordanza con le analisi diagnostiche standard evidenziata nello stadio IV consente di considerare la TH quale utile parametro predittivo alla diagnosi Negli stadi localizzati, dove in 3/24 (12.5%) è stata osservata la positività isolata dellespressione della TH suggestiva di infiltrazione midollare minima, questa indagine potrebbe rappresentare un valido strumento di approfondimento diagnostico Negli stadi localizzati, dove in 3/24 (12.5%) è stata osservata la positività isolata dellespressione della TH suggestiva di infiltrazione midollare minima, questa indagine potrebbe rappresentare un valido strumento di approfondimento diagnostico La valutazione della TH inoltre potrebbe entrare tra le analisi diagnostiche indici di contaminazione neoplastica di cellule staminali emopoietiche periferiche o midollari raccolte in pazienti positivi alla diagnosi () La valutazione della TH inoltre potrebbe entrare tra le analisi diagnostiche indici di contaminazione neoplastica di cellule staminali emopoietiche periferiche o midollari raccolte in pazienti positivi alla diagnosi (studio in corso)


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