Soluzione lisante + PK Purificazione del DNA proteine DNA membrane etanolo Sovranatante Contenente DNA.

Presentazione sul tema: "Soluzione lisante + PK Purificazione del DNA proteine DNA membrane etanolo Sovranatante Contenente DNA."— Transcript della presentazione:

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2 Soluzione lisante + PK

3 Purificazione del DNA proteine DNA membrane etanolo Sovranatante Contenente DNA

4 nucleotidi primers TAQ polimerasi MIX DNA

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8 catodo anodo

9 Gel in cui sono stati praticati i pozzeti per la semina di campioni Caricamento dei campioni Risultato dell’elettroforesi. I campioni sono evidenziati agli UV La fluorescenza è ottenuta mediante una molecola intercalante capace di inserirsi nella doppia elica del DNA e di renderlo visibile agli UV

10 DNA amplificato Enzimi di restrizione elettroforesi RFLPs Polimorfismi per la lunghezza dei frammenti di restrizione Elettroforesi mediante sequenziatore VNTRs Polimorfismi di lunghezza per le ripetizioni in tandem SNPs Polimorfismi per sostituzione di un singolo nucleotide Elettroforesi mediante sequenziatore

11 L’enzima di restrizione o endonucleasi taglia il DNA in corrispondenza di una sequenza specifica. Se nella sequenza in questione un nucleotide muta, l’enzima non riconosce più la successione nucleotidica e non può tagliare la doppia elica RFLPs

12 - + pozzetti -/-+/--/- +/--/- RFLP

13 Sequenziatore di DNA ABI Prism 3700 ABI PRISM 310

14 SNPs

15 ACGTT VNTRs ACGTT Unità di ripetizione 1 2 Tracciato elettroforetico 1 2 - +

16 1 2 Tracciato elettroforetico digitalizzato 1 2 ACGTT

17 HVR 1 HVR2 16000-16365 73-440 Non codificante

18 aplotipo SEQUENZA DI RIFERIMENTO ACTGGGTCCACCCTGATGTG ACCGGGTCCACCCTGATGTG ACTGGATCCACCCCGATGTG Aplotipo 1 Aplotipo 2

19 aplogruppo..ACCCTG....ACTCTG....ACCCCG....ATCTTG....ATTTTG.. Aplogruppo A Aplogruppo B

20 L3 N M T J K H U

21 Studio del DNA antico metodo di datazione mediante racemizzazione degli aminoacidi Due forme speculari: isomeri ottici o enantiomeri Negli organismi viventi esiste la forma levogira Dopo la morte in funzione del tempo e della temperatura gli aminoacidi tendono a diventare destrogiri All’equilibrio tra le due forme la luce non viene più deviata e la soluzione si dice racemica LeuPhe

22 Danneggiamenti del DNA antico Degradazione: rotture, modificazioni delle basi, mancanza di basi, legami intrafilamento dovuti all’azione dell’acqua dell’ossigeno e dei batteri Danneggiamenti durante la lavorazione: rottura del doppio filamento Contaminazione: introduzione di molecole di DNA moderno nel campione in esame che ostacola l’evidenza di molecole di DNA antico

23 Trattamento dei campioni Uso di guanti, camici, mascherine Trattamento degli strumenti con HCl e acqua distillata Vetreria sterile Uso di UV Lavorazione in laboratori adibiti solo al DNA antico Ripetere le analisi e verificare la ripetibilità dei risultati sullo stesso campione anche in laboratori diversi

24 Durante la PCR possono verificarsi errori di incorporazione soprattutto dove mancano delle basi a causa della degradazione del DNA Al termine della PCR l’amplificato può contenere frammenti di DNA che non sono tutti uguali

25 Clonazione degli amplificati: ha la funzione di discriminare gli amplificati Analisi delle sequenze nucleotidiche dei cloni Confronto delle sequenze clonate

26 Sequenza di Anderson (1981) “sequenza di riferimento di Cambridge”

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29 (MIX) QUANTITA’ PER CAMPIONE H2O 19,5 μl Tampone2,5 μl MgCl20,75 μl Nucleotidi (A-T-C-G) 0,5 μl Primer for0,5 μl Primer rev0,5 μl Taq0,25 μl 1) MOLTIPLICARE PER IL NUMERO TOTALE DEI CAMPIONI 2) DISPENSARE 24 μl DI MIX AD OGNI PROVETTA DA PCR 3) AGGIUNGERE 2 μl DI DNA AD OGNI PROVETTA DA PCR