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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico.

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Presentazione sul tema: "PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico."— Transcript della presentazione:

1 PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

2 PCR da DNA genomico

3 PCR da mRNA (RT-PCR)

4 Uso dei “linkers”

5 Vettori dA:dT 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

6 PCR da DNA genomico EcoRI BamHI EcoRI

7 promTag o rep. cDNA term trascrizione traduzione Proteine di fusione

8

9 Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide

10

11

12 Elettroforesi su gel di agarosio

13

14 Tamponi di elettroforesi

15 Soluzioni di caricamento

16 Aumentano la densità del campione Colorano il campione Rendono visibile la corsa elettroforetica

17 Migrazione del DNA su gel

18 Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

19 Visualizzazione del DNA

20 Marcatori di peso molecolare HindIII

21 Fotodocumentazione

22

23 Recupero DNA da gel Elettroeluizione Agarosio “low melting” Solubilizzazione agarosio

24 Gel di acrilammide

25 Apparato per gel di acrilammide

26 Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

27

28

29 Metodo di Sanger primer nuovo DNA dideossinucleotide terminatore quattro dNTP (incluso 32PdNTP) DNA polimerasi La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP Denaturare e separare su gel di poliacrilammide ddTTPddCTPddGTPddATP

30 Metodo di Maxam e Gilbert DNA singolo filamento marcato ad una estremità 4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Es. metilazione delle G con dimetilsolfato Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide 32 P

31 Gel di poliacrilammide di sequenza

32

33 Fasi di un progetto di sequenziamento clonaggio e preparazione del DNA reazioni di sequenza elettroforesi su gel di poliacrilammide interpretazione e raccolta dati

34 Vettori a singolo filamento

35 Fagemidi

36 Strategie di sequenziamento Primer specifici consecutivi Delezioni progressive Frammenti casuali (shotgun)

37 Reazioni base-specifiche

38 Confronto metodi di sequenziamento Sanger  rapida e semplice attuazione  disponibilità di kit  necessità di primer  sensibile a strutture secondarie Maxam e Gilbert  lunga preparazione del DNA  reazioni da mettere a punto  relativamente economico  strutture non influenti  utilizzabile per oligonucleotidi

39 Sequenziamento automatico

40 Sequenziamento con Taq polimerasi


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