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RADICALI LIBERI Il temine radicale chimico, introdotto nel 1832 da Liebig e Wohler, indicava un gruppo di atomi, appartenente ad una molecola di un composto.

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1 RADICALI LIBERI Il temine radicale chimico, introdotto nel 1832 da Liebig e Wohler, indicava un gruppo di atomi, appartenente ad una molecola di un composto organico (CH 3 -, radicale metile; C 2 H 5 -, radicale etile; ecc.), Agli inizi del secolo scorso Gomberg preparò per la prima volta un radicale: il trifenilmetile (C 6 H 5 ) 3 C I radicale liberi (R ) sono specie chimiche capaci di esistenza indipendente, che possiedono uno o più elettroni spaiati nei loro orbitali. Fra i radicali più semplici vi sono lidrogeno atomico (H )e quasi tutti i metalli nella prima riga del gruppo di transizione nella tavola periodica Configurazioni elettroniche del ferro nei suoi tre più comuni stati di ossidazione I radicali liberi sono paramagnetici in quanto il numero magnetico totale dei loro elettroni è diverso da zero. I radicali sono generalmente più reattivi delle specie non radicaliche poiché gli elettroni di solito sono più stabili quando sono accoppiati Alcune reazioni si verificano non appena due specie reagenti vengono a contatto e si definiscono processi controllati dalla diffusione. Fra i radicali sono comprese specie chimiche stabili come lossido nitrico (NO ), il biossido di azoto (NO 2 ) e lossigeno (O 2 )

2 REAZIONI RADICALICHE Fase iniziale: formazione di un radicale libero dovuta a: Trasferimento di un elettrone da o ad una specie non radicalica Rottura omolitica di un legame covalente Fase di propagazione: produzione di un nuovo radicale, attraverso: Addizione del radicale ad unaltra molecola con formazione di un addotto con un elettrone spaiato Cessione di un elettrone ad unaltra molecola, la quale presenta un elettrone spaiato Accettazione di un elettrone da unaltra molecola, la quale rimane con un elettrone spaiato. Estrazione di idrogeno da un legame C-H dando origine ad un radicale centrato su un carbonio Fase terminale: Eliminazione dei radicali per combinazione fra essi

3 TOSSICITA DELLOSSIGENO LO 2 è un biradicale che è tossico ad elevate concentrazioni La tossicità, prima attribuita ad inattivazione enzimatica, è dovuta a radicali o altre specie reattive dellossigeno (ROS) Alla tossicità dell O 2 è dovuta la retinopatia dei prematuri Disposizione degli elettroni nellossigeno e nei suoi dertivati LO 2 è scarsamente reattivo poiché i due elettroni spaiati sono paralleli e, quindi, difficili da accoppiare con gli elettroni delle molecole organiche che sono antiparalleli (restrizione di spin) Due elettroni non di legame hanno uno spin totale di 0 (spin opposti) o di 1 (spin eguale). Le due condizioni sono definite stato di singoletto e stato di tripletto. La restrizione di spin può essere aggirata trasformando 3 O 2 in 1 O 2, ma lentità di questa trasformazione negli organismi viventi è troppo piccola

4 Reattività dellossigeno La restrizione di spin è normalmente aggirata mediante lausilio di sostanze (metalli di transizione o sostanze che li contengono) in grado di trasferire allossigeno elettroni col giusto spin. Formazione degli intermedi ridotti dell O 2 nel sito della citocromo ossidasi Fasi della trasformazione dellossigeno in acqua da parte della citocromo ossidasi La citocromo ossidasi è in grado di cedere gradualmente quattro elettroni all O 2 Gli intermedi di riduzione dell O 2 rimangono saldamente legati nel sito attivo della citocromo ossidasi

5 ROS E RNS Le ROS non sono limitate agli intermedi di riduzione dellossigeno, ma comprendono anche altre specie radicaliche, che presentano un elettrone spaiato sullatomo di ossigeno come il radicale alcossile RO ed il radicale perossile ROO, e specie non radicaliche come l 1 O 2 Tabella 1 Specie reattive dellossigeno (ROS) Radicali O 2 - Radicale superossido OHRadicale ossidrile RO Radicale alcossile ROO Radicale perossile Non radicali H 2 O 2 Perossido di idrogeno HOClAcido ipocloroso 1 O 2 Ossigeno singoletto O 3 Ozono Tabella 2 Specie reattive dellazoto (RNS) Radicali NO Ossido nitrico NO 2 Biossido dazoto Non radicali HNO 2 Acido nitroso N 2 O 4 Tetrossido dazoto ONOO - Perossinitrito

6 Riduzione univalente dellossigeno Nel 1954 fu proposto che gli effetti dannosi dell'O 2 erano dovuti alla formazione dei suoi radicali Questa ipotesi, con la scoperta della superossido-dismutasi, si trasformò nella "teoria del superossido, che prevedeva che la tossicità dell'O 2 era dovuta alla sua riduzione univalente a O 2 - In realtà, la formazione di O 2 - porterebbe alla formazione degli altri intermedi della riduzione dellossigeno. L O 2 -, prendendo un elettrone si converte in H 2 O 2 : L H 2 O 2 può interagire con ioni metallici di transizione nella forma ridotta, come Fe 2+ (o Cu + ), che lo decompongono nel radicale OH (Reazione di Fenton): LO 2 - può dare origine a Fe 2+ (o a Cu + ) riducendo Fe 3+ (o Cu 2+ ),: Combinando le due equazioni si può scrivere la reazione complessiva di Haber-Weiss: Poiché il ferro è presente in quantità significative nei sistemi viventi, è considerato il più importante generatore di radicali liberi.

7 PRODUZIONE DI RADICALI LIBERI AGENTI ESTERNI Radiazioni elettromagnetiche (raggi x e raggi ) Particelle atomiche (elettroni, protoni, neutroni, e particelle e ) Xenobiotici (pollutanti fotochimici, pesticidi, solventi, anestetici, farmaci, idrocarburi aromatici). Gli xenobiotici, derivanti da fonti naturali o androgene possono esistere come radicali liberi o essere convertiti in tali specie, dopo assorbimento, da processi di detossificazione cellulare. METABOLISMO CELLULARE SITI DI PRODUZIONE Mitocondri (catena respiratoria) Citoplasma (xantina ossidasi) Microsomi (sistema monoossigenasico) Membrana (lipoossigenasi) Perissosomi (enzimi ossidasi) Fagociti (NADPH-ossidasi). Sorgenti cellulari di radicali liberi

8 PEROSSIDAZIONE LIPIDICA Gli acidi grassi polinsaturi (PUFA) dei fosfolipidi di membrana subiscono un processo a catena noto come perossidazione lipidica Il deterioramento, dipendente dallO 2, dei lipidi negli alimenti è noto come irrancidimento ossidativo Il processo può essere innescato da un qualsiasi radicale capace di estrarre un atomo di H da un gruppo metilenico reattivo di un PUFA ( OH, RO, ROO, R ) e i complessi del ferro con lO 2 quali il perferrile ([ ]) ed il ferrile (X-[ ]). La velocità è aumentata dalla temperatura, dalla luce in presenza di attivatori come la clorofilla, da rdiazioni ionizzanti Sequenza degli eventi della perossidazione lipidica La perossidazione lipidica è un processo autocatalitico, in grado di convertire parecchie centinaia di acidi grassi in idroperossidi, a meno che non sia presente un antiossidante (chain-breaking) capace di in- terrompere la fase di propagazione cedendo un H al radicale perossilico

9 Prodotti della perossidazione lipidica Durante la perossidazione si ottengono diversi prodotti secondari: Idrocarburi, esteri, aldeidi, chetoni, alcoli, acidi, polimeri, epossidi, molti dei quali responsabili dellodore di rancido dei grassi ossidati La formazione dei composti è dovuta a reazioni di frammentazione della catena, che coinvolgono radicali perossilici Frammentazione di radicali perossilici Le aldeidi formano basi di Schiff con gli ammino gruppi di proteine. La malondialdeide forma legami crociati con proteine, portando alla formazione di aggregati proteici. Altri derivati aldeidici gli -alchenali (in particolare il 4-idrossi-nonenale), esercitano numerosi effetti deleteri. Malondialdeide (MDA) e 4-idrossinonenale (4-HNE) Conseguenze della perossidazione lipidica Perdita di grassi polinsaturi Diminuzione di fluidità lipidica Alterazione della permeabilità della membrana Danni agli enzimi associati alla membrana Alterato trasporto ionico Produzione di metaboliti tossici degli idroperossidi

10 DANNI ALLE PROTEINE H 2 O 2 ha effetto solo sui gruppi –SH delle proteine, mentre l OH può generare un gran numero di prodotti finali Ossidazione radicalica delle proteine Gli intermedi radicalici previsti dalla sequenza di reazioni possono dare reazioni collaterali con altri radicali aminoacidici generando un nuovo radicale carbonilico e propagando la reazione a catena In assenza di O 2, la reazione 1 non si verifica, e due radicali carbonilici possono reagire formando un derivato proteina-proteina Con radicali derivanti dalla ossidazione di lipidi e proteine si producono aggregati proteina-lipide: ; Il legame C-C del radicale alcossilico (Reazione 4) si può rompere con conseguente frammentazione della proteina Rottura di un legame C-C e frammentazione della proteina

11 Ossidazione delle catene laterali di aminoacidi Catene laterali di aminoacidi sono suscettibili all OH Ossidazione della cisteina Ossidazione della metionina Le forme ossidate di metionina e cisteina sono riconvertite da riduttasi La tirosina può essere idrossilata a diidrossifenilalanina (DOPA), o formare radicali che possono formare dimeri Formazione di dimeri della tirosina. Il perossinitrito può ossidare metionina e cisteina, nitrare tirosina e triptofano, facendo perdere alla tirosina la capacità di andare incontro alla interconversione tra forma fosforilata e non fosforilata I prodotti carbonilici, derivati dalla degradazione dei perossidi lipidici, possono interagire con i residui amminoacidici delle proteine alterandone la natura e la carica elettrica La MDA può legare due proteine producendo basi di Schiff coniugate rivelabili per la fluorescenza della struttura formata Interazione della MDA con le proteine

12 Destino delle proteine ossidate Lossidazione delle proteine può portare al loro accumulo In cellule sane, laccumulo di proteine ossidate è prevenuto dalla eliminazione, poiché esse sono più suscettibili alla proteolisi. Nelle cellule dei mammiferi le proteine sono scisse da catepsine lisosomali, calpaine attivate dal calcio e proteasomi 20S e 26S. Il proteasoma 20S ha una preferenza per i residui idrofobici ed è responsabile di circa il 60-70% dellaumentata degradazione cellulare di proteine dopo esposizione ad ossidanti Le proteine degradate sono sostituite da altre sintetizzate de novo, che contengono grandi quantità di aminoacidi riciclati Se lattacco ossidativo è forte, può essere superata la capacità proteolitica delle cellule. In tali condizioni le proteine non digerite possono formare aggregati dannosi per la normale funzione cellulare Sebbene la progressiva ossidazione di una proteina aumenti la sua degradazione da parte del proteasoma, quelle severamente ossidate e che formano legami intramolecolari possono essere resistenti alla degradazione. Gli aggregati proteici e le proteine alterate dai prodotti aldeidici della perossidazione lipidica, non solo sono più resistenti alla proteolisi, ma possono essi stessi inibire le proteasi nella loro azione

13 Glicosilazione delle proteine Le proteine subiscono glicosilazione non enzimatica attraverso la reazione di Maillard Il glucosio forma, con gruppi -NH 2 di proteine [-NH 2 termi- nale o di catene laterali di lisi- na (R = NH2-(CH2) 4 -) e argini- na (R = NH=CNH 2 -NH-(CH2) 3 - basi di Schiff, le quali danno un prodotto precoce di glicosilazio- ne (EGP) (prodotto di Amadori) In vivo la quantità di EGP è molto elevata nell'emoglobina e nelle membrane basali dei diabetici. Gli EGP possono trasformarsi in prodotti avanzati di glicosilazione (AGE), che sono responsabili della formazione di aggregati proteici, detti melanoidine, di colore bruno, che si accumulano nei tessuti Si ritiene che l'iperglicemia provochi la formazione di legami tra lipoproteine plasmatiche, penetrate nella parete arteriosa, e proteine della matrice connettivale. Così si rallenta l'efflusso del colesterolo dall'intima delle arterie e si accentuano le lesioni aterosclerotiche. Imbrunimento non enzimatico degli alimenti La reazione di Maillard si verifica in alimenti che contengono zuccheri (o composti carbonilici) e proteine modificandone i caratteri organolettici e le proprietà nutrizionali La reazione è favorita da calore, luce, metalli e pH leggermente alcalino La formazione di pigmenti bruni (imbrunimento non enzimatico), può anche essere ottenuta per polimerizzazione dellidrossimetilfurfurolo o del furfurolo

14 DANNI AI GLUCIDI L OH attacca i monosaccaridi formando radicali idrossialchilici e quindi composti bicarbonilici, che si possono ottenere anche in processi che richiedono la presenza di ioni metallici La enolizzazione del glucosio porta ad una struttura anionica, abbastanza stabile, di tipo "endiolo" la quale può ridursi di nuovo a glucosio, o ossidarsi ulteriormente a composto carbonilico. La ossidazione, catalizzata da forme ossidate di ioni metallici, porta alla formazione di un radicale, che poi si trasforma in un composto bicarbonilico. Le ROS prodotte nella reazione possono ossidare altre molecole di glucosio formando più prodotti bicarbonilici che, reagendo con i gruppi amminici delle proteine, ne altera la struttura e la funzione Ossidazione radicalica del glucosio La lenta trasformazione degli EGP in AGE può essere dovuta ad ossidazione da parte delle ROS. Perciò queste specie sono state descritte come fissativi di glicazione. Gli AGE possono anche essere formati mediante una preventiva ossidazione del glucosio e successiva reazione del prodotto di ossidazione con le proteine

15 DANNO OSSIDATIVO AL DNA L OH può reagire con le basi del DNA modificandole o con lo scheletro di ribosio-fosfato portando alla scissione dellelica del DNA Reazione del DNA con il radicale idrossilico In studi in vitro sono state isolate varie forme di DNA danneggiato e diversi derivati di basi alterate. La presenza nei tessuti e l'escrezione con l'urina di tali basi indica un danno subito in vivo dal DNA Il marker più usato è la 8-deossiidrossi-guanosina (8-OHdG), formata per attacco di OH alla guanina, ed ossidazione del radicale risultante Modificazione della guanina da parte del radicale idrossilico La determinazione prevede lisolamento con triclorometile, la precipitazione con etanolo e la digestione del DNA fino a deossinucleosidi. Le concentrazioni di 8-OHdG e della deossiguanosina (dG) sono misurate con HPLC, ed il loro fornisce il danno al DNA Le proteine, che legano il DNA nucleare in vivo, lo rendono meno suscettibile al danno ossidativo rispetto al DNA isolato in vitro. Il DNA mitocondriale è più suscettibile all'ossidazione del DNA nucleare

16 SISTEMA DI DIFESA ANTIOSSIDANTE L'organismo possiede meccanismi biochimici per la difesa contro i danni da radicali liberi. Difesa antiossidante prevenzione intercettazione restauro L'intercettazione è dovuta a sostanze che interrompono reazioni a catena radicaliche. La difesa contro radicali molto reattivi si può verificare solo mediante prevenzione o restauro poiché gli agenti capaci di intercettazione dovrebbero essere presenti a concentrazioni elevate Il restauro si verifica mediante meccanismi enzimatici. Esso è importante sia per riparare un danno al DNA prima che esso diventi una mutazione, sia nel restauro di fosfolipidi mediante reazioni di reacilazione. Una definizione di antiossidante è "qualsiasi sostanza che, presente a concentrazioni basse rispetto a quelle di un substrato ossidabile, ritarda o inibisce significativamente l'ossidazione di tale substrato". I sistemi di difesa antiossidante sono costituiti da enzimi e da sostanze antiossidanti a basso peso molecolare (free radical scavengers).

17 Glutatione Il glutatione (GSH), -glutamil-cistein-glicina, è il più abbondante tiolo presente nelle cellule dei mammiferi. Esso è sintetizzato in vivo in due fasi. La -glutamilcisteina sintetasi catalizza la formazione del dipeptide Il prodotto è convertito a GSH dalla glutatione sintetasi La glutamilcisteina sintetasi è inibita dalla butionina sulfossimina che è usata in esperimenti per diminuire i livelli cellulari di GSH. La concentrazione del GSH è generalmente 0.5 mM, ma può raggiungere il valore di 10 mM. Il GSH ha una mezza vita è di 4 giorni negli eritrociti umani e di 3 ore nel fegato di ratto. Il GSH e i suoi coniugati, prodotti dalla glutatione transferasi, possono essere degradati dalla -glutamiltranspeptidasi che trasferisce il residuo di glutammato ad altri aminoacidi. Il GSH può essere esportato nel plasma principalmente dal fegato, che possiede almeno due meccanismi di trasporto e due diversi carriers per esportare il GSH nel plasma e nella bile.

18 Ruolo del GSH Cofattore della glutatione perossidasi; Funzione antiossidante legata al gruppo tiolico; Funzione detossificante Il GSH previene lossidazione dei gruppi –SH delle proteine e quindi della formazione di legami intra- ed intermolecolari. Può formare complessi con ioni Cu + diminuendo la loro capacità di generare radicali OH. E coinvolto nel metabolismo di xenobiotici nei tessuti animali e vegetali. Le foglie di mais contengono un enzima che detossifica lerbicida atrazina combinandolo con il GSH. Enzimi epatici glutatione-S-transferasi (GST) promuovono la coniugazione di xenobiotici (cloroformio, nitrati organici, bromobenzene, DDT, naftalene, paracetamolo) con il GSH. I coniugati sono escreti nella bile usando pompe di efflusso, le quali sono anche coinvolte nelleliminazione di GSSG. Laddotto può anche essere degradato ed acetilato per formare coniugati della N-acetilcisteina (acidi mercapturici) che sono escreti nellurina. Grosse quantità di xenobiotici riducono il GSH epatico, riducendo così la capacità antiossidante del fegato.

19 Acido urico Lacido urico (a pH fisiologico quasi tutto presente come urato, pK a = 5,4), è un prodotto terminale del metabolismo delle purine nei primati, che mancano dellenzima perossisomale urato ossidasi, che converte lurato in allantoina, che è poi convertita in prodotti più solubili in acqua dellurato. Degradazione dellacido urico Lurato si accumula nel plasma umano a concentrazioni 0,2-0,4 mM ed è escreto nellurina. Nelle cellule ed nei fluidi corporei è presente a livelli più bassi (0,1-0,2 mM nella saliva). Uneccessiva produzione in vivo può portare alla sua cristallizzazione. Questo si verifica nella gotta, malattia trattata con con lallopurinolo, un inibitore della xantina ossidasi. Il carattere doloroso degli attacchi di gotta, causati dalla infiammazione delle giunture innescata dalla deposizione dei cristalli di urato, è stato riconosciuto sin dallantichità ed ha afflitto limperatore romano Claudio, Enrico VIII e Beniamino Franklin.

20 Proprietà antiossidanti dellurato Il riconoscimento dellurato come antiossidante biologico è recente. Forti ossidanti, come l OH, ossidano lurato a radicale libero. La delocalizzazione dellelettrone sullanello purinico stabilizza il radicale, che non sembra reagire con lO 2 e formare un radicale perossilico. A pH 7, il potenziale di riduzione del sistema urato/urato radicale è più alto di quello dellascorbato (E = 0,59 vs. - 0,28 V), per cui lascorbato riduce il radicale urato. Lurato reagisce anche con radicali perossilici organici: Il fatto che lurato è un potente scavenger dell OH e dei radicali perossilici in vitro suggerì che esso si comportava come un antiossidante in vivo e che la perdita dellurato ossidasi era stata vantaggiosa per i primati. In seguito si scoprì che lurato è un potente scavenger dellO 3 e del NO 2 e può proteggere il tratto respiratorio da questi ossidanti. Lurato protegge anche le proteine contro la nitrazione dovuta ad addizione di ONOO - e può chelare ioni metallici, come Fe e Cu, in forme con scarsa capacità di catalizzare reazioni radicaliche. Consistente con il ruolo antiossidante dellurato in vivo sono lalto livello presente, sufficiente per spazzare ROS e RNS, e losservazione che, in pazienti soggetti ad attacco ossidativo, aumenta la concentrazione di prodotti di degradazione dellurato, fra cui lallantoina, da parte dei ROS.

21 SISTEMI ENZIMATICI ANTIOSSIDANTI Superossido dismutasi e catalasi La superossido dismutasi (SOD) catalizza la conversione di O 2 - in H 2 O 2, prevenendo lazione tossica di O 2 - sui tessuti. Vi sono due SOD: una Mn-dipendente localizzata nei mitocondri; l'altra Cu- e Zn-dipendente localizzata nel citoplasma. LH 2 O 2 prodotta dalla SOD deve essere convertita in H 2 O per impedire che i complessi degli ioni metallici la convertino in OH. Uno degli enzimi implicato nella degradazione dellH 2 O 2 è la catalasi (CAT): La CAT ha un'attività elevata nel fegato, nel rene e negli eritrociti. Tale attività aumenta quando aumenta la produzione di H 2 O 2. Oltre che nei perissosomi, essa è localizzata nei mitocondri di cuore e fegato.

22 Glutatione perossidasi e glutatione riduttasi La glutatione perossidasi (GPX) rimuove H 2 O 2, utilizzando come donatore di idrogeno il GSH. Le GPX agiscono preferenzialmente sui perossidi organici. La GPX consiste di quattro subunità proteiche, ciascuna delle quali contiene nel sito attivo un atomo di Se come selenocisteina, per cui tracce di Se sono essenziali nella dieta. Le GPX sono presenti in tutti i tessuti, particolarmente in quelli a basso contenuto di CAT (muscolo e regioni del cervello). Il fegato contiene alte concentrazioni di entrambi gli enzimi. La GPX è presente principalmente nel citosol. La matrice mitocondriale contiene circa il 10% del totale. Le glutatione-S-transferasi (GST) catalizzano reazioni dei perossidi organici con il GSH formando GSSG ed alcoli. Alcune hanno unattività GPX -simile, e furono chiamate GPX Se-indipendenti. Non è chiaro metabolizzano i perossidi in vivo. Lefficienza del sistema GPX-GSH richiede la riconversione del GSSG a GSH catalizzata dalla glutatione riduttasi (GR), la quale mantiene il rapporto GSH/GSSG ad un livello alto (> 10 : 1). La reazione richiede NADPH che è prodotto nel ciclo dei pentoso- fosfato mediante l'intervento sia della glucosio-6-fosfato deidrogenasi che della 6-fosfogluconato deidrogenasi. Laumentata ossidazione delle catecolamine (da parte delle monoamine ossidasi) è correlata con laccelerazione del ciclo dei pentoso-fosfati, richiesta per produrre NADPH necessario per le reazioni catalizzate dalla GR e dalla aldeide riduttasi.

23 Proteine leganti il ferro ed il rame Ee e Cu, sebbene necessari per la sintesi di enzimi ed altre pro- teine coinvolte in reazioni redox, sono potenzialmente dannosi: ; Alcuni trasferimenti elettronici sono coinvolti nella catalisi di ossidazioni (adrenalina, dopamina, ascorbato), della conversione di H 2 O 2 a OH e decomposizione di ROOH a ROO e RO. Fe ematico libero può essere letale. Complessi a basso peso molecolare (Fe-citrato o Fe-ATP) e proteine emiche catalizzano la reazione di Fenton, per cui gli animali hanno proteine per trasporto e conservazione di Fe. Nel circolo Fe è legato alla transferrina, ad alta affinità e bassa capacità di legame (2 Fe per molecola), che si lega a recettori sulla superficie delle cellule che richiedono Fe. La lactoferrina si trova in diversi fluidi secretori (saliva, muco vaginale, fluido seminale, bile, secrezioni nasali, latte) lega 2 Fe +3 per molecola. La ferritina,a bassa affinità ed alta capacità (4500 Fe per mole- cola), immagazzina il Fe intracellulare ossidandolo a Fe 3+ (Fe 2 O 3 idratato insolubile). Si lega a recettori sulla superficie di cellule che immagazzinano Fe (cellule reticolo-endoteliali). In circolo Cu si lega allalbumina, è preso dal fegato ed incor- porato nella ceruloplasmina (ferroossidasi) (6 ioni fortemente legati e un settimo meno fortemente), che è secreta nel plasma dove catalizza lossidazione di Fe +2 a Fe +3, e cede Cu alle cellule richiedenti dove si lega probabilmente al GSH.

24 Schema generale del sistema di difesa antiossidante.

25 STRESS OSSIDATIVO In diverse condizioni la velocità di produzione dei radicali liberi supera la capacità dei sistemi di difesa cellulare. Il disturbo nel bilancio tra proossidanti ed antiossidanti in favore del primo è definito "stress ossidativo" Fattori che influenzano il bilancio fra pro-ossidanti ed antiossidanti. Altri ricercatori hanno definito stress ossidativo l'aumentata generazione di radicali liberi implicando che questo termine è sinonimo di danno. L'idea è che un tessuto, esposto a grandi quantità di ROS, non è in grado di mantenere il rapporto normale GSH/GSSG e il GSSG si accumula. Questo porterebbe ad un disturbo dello stato redox intracellulare, inattivazione di enzimi con gruppi sulfidrilici nei siti attivi, e formazione di disolfuri misti inter- o intramolecolari.

26 Cause di aumentata produzione di ROS Cause e conseguenze dellaumentata produzione di radicali Esposizione a radiazioni ionizzanti, fumo di sigaretta, alta pO 2. Esposizione a xenobiotici (paraquat, cloroformio, tetracloruro di carbonio) e farmaci (paracetamolo, doxorubicina) che producono specie radicaliche durante il loro metabolismo. Aumento del metabolismo aerobico Si assume che O 2 - è generato nei mitocondri a velocità correlata alla velocità di consumo dell O 2. Non vi sono prove convincenti a riguardo, ma stati ipermetabolici, come ipertiroidismo ed esercizio portano a stress ossidativo favoriscono una maggiore produzione di ROS

27 DIFESE CONTRO LO STRESS OSSIDATIVO La nutrizione ha un ruolo nel prevenire le malattie: Vitamina D e calcio possono ridurre il rischio di osteoporosi e di cancro del colon. Alti livelli ematici di vitamina C sono associati con bassi livelli della pressione sanguigna. Una dieta a basso contenuto di Na è usata dagli ipertesi Lidea che una adeguata nutrizione serva nelle malattie dovute ai radicali liberi ha suggerito che siamo alla soglia di una seconda rivoluzione nella comprensione del ruolo della nutrizione nel mantenimento della salute La prima è legata alla scoperta di malattie da carenza nutrizionale e portò alla loro eliminazione La seconda coinvolgerebbe i nutrienti antiossidanti, e porterebbe a ridurre il rischio di cancro, malattie cardiovascolari ed altre patologie legate alletà

28 Potenziale antiossidante Gli alimenti contengono molte sostanze ad azione antiossidante Per valutare il loro potenziale antiossidante sono considerati molti criteri, alcuni importanti per scopi preventivi e terapeutici. Specificità dello spegnimento di radicali liberi Attività di complessazione di metalli Interazioni con altri antiossidanti Effetti sullespressione genica Assorbimento e biodisponibilità Livelli nei tessuti, nelle cellule e nei fluidi extracellulari Localizzazione Un buon ossidante non deve soddisfare necessariamente tutti questi criteri

29 VITAMINA E Nel 1922 fu scoperto che femmine di ratto nutrite con caseina, farina di cereali e lardo rancido presentavano aborto e riassorbimento del feto, che erano prevenuti da lattuga e frumento intero, che contenevano un fattore per la riproduzione (vitamina E) Lassenza di tale fattore provocava ai maschi una lesione irreversibile ai testicoli. Dallolio di germi di frumento fu isolato (1936) il fattore ( -tocoferolo) Lattività della vitamina E deriva da due gruppi (tocoferoli e tocotrienoli) di 4 sostanze con differenti attività biologiche: Le attività di - e -tocoferolo sono il 50% e il 10% di quella di -tocoferolo Lattività di -tocotrienolo è il 30%, e quella degli altri composti è molto bassa

30 Struttura della vitamina E Derivati liposolubili del 2-metil-6-cromanolo; Catena isoprenoide (16 C) sul C2, 1-3 gruppi -CH 3, 3 doppi legami nella catena dei tocotrienoli; Stabili a calore ed acidi, instabili ad alcali, luce ultravioletta e O 2

31 Biodisponibilità Il contenuto di vitamina E è espresso come equivalenti di -tocoferolo ( -TE mg/kg) ed è: Elevato in oli vegetali (soia, mais, girasole) e derivati (margarina e maionese). Apprezzabile in germe di grano, noci e vegetali a foglia verde Modesto in cereali (alcuni usati per prima colazione sono integrati con acetato di -tocoferolo) ed alimenti di origine animale (solo -tocoferolo) Basso in frutta fresca e nei vegetali Il contenuto nelle piante dipende dalla specie, varietà, stadio di maturazione, condizioni di raccolta, trattamento e conservazione

32 Richiesta di vitamina E La richiesta di vitamina E dipende dallo stile di vita e dalla dieta per cui è alta con diete ricche di PUFA Livelli sierici minori di 0,5 mg/dl sono considerati vitamina E deficienti Introduzioni di mg negli adulti sani mantengono normali i livelli sierici (circa 1 mg/dl) Assorbimento Lassorbimento, uguale per le varie forme (20-80% della vitamina ingerita) diminuisce con la dose ingerita ed aumenta con lingestione di lipidi Esteri dei tocoferoli (acetato, succinato) sono idrolizzati da lipasi pancreatiche e i tocoferoli assorbiti La solubilizzazione della vitamina in micelle richiede sali biliari e secrezioni pancreatiche La vitamina diffonde negli enterociti, è veicolata da proteine di trasporto, e secreta in chilomicroni

33 Messa in circolo La lipasi delle lipoproteine idrolizza i chilomicroni sulla superficie dei capillari, portando al trasferimento di acidi grassi e tocoferoli ai tessuti Nel processo, ApoE si lega ai residui dei chilomicroni, che sono presi dal fegato che ha recettori per ApoE L -tocoferolo è trasferito da una proteina epatica a VLDL (le altre forme sono secrete nella bile), la cui secrezione mantiene i livelli sierici del tocoferolo La lipasi delle lipoproteine e la lipasi epatica dei trigliceridi convertono le VLDL a LDL, che trasportano la maggior parte dei tocoferoli sierici e li scambiano con le HDL, da cui sono trasferiti ai residui dei chilomicroni e restituiti al fegato

34 Trasferimento ai tessuti I tocoferoli passano ai tessuti con lidrolisi dei chilo- microni, ma anche dalle LDL, mediante i recettori delle LDL e diffusione transmembranaria I tocotrienoli, assorbiti come i tocoferoli, sono elimi- nati con i chilomicroni e depositati nel tessuto adiposo con i trigliceridi La vitamina E si accumula nelle membrane cellulari ricche di fosfolipidi La regolazione di livelli ematici e tessutali dipende dalla proteina legante il tocoferolo poiché laffinità per i tocoferoli è riflessa nei loro livelli ematici e tessutali, e pazienti privi della proteina hanno concen- trazioni molto basse di -tocoferolo. Larghe dosi di tocoferolo aumentano 2-4 volte i livelli ematici. Con dosi maggiori gli ulteriori aumenti sono piccoli

35 Livelli ematici e tessutali I livelli ematici (1,06 mg/dl) raddoppiano con integrazione di 800 IU (800 mg di acetato di tocoferolo) per 8 settimane Linfusione di -tocoferolo, evita assorbimento e trasporto normali, ed aumenta 10 volte il livello ematico, che, in 24 ore, ritorna al valore basale Plasma e tessuti umani contengono 2-3 volte più - che -tocoferolo, anche se la dieta contiene più - tocoferolo Il livelli di tocotrienoli sono bassi anche se essi sono consumati quanto l -tocoferolo. Livelli alti di -tocoferolo si trovano nella midollare del surrene e nel tessuto adiposo (il sito di deposito). Nel fegato, sito del catabolismo e dellescrezione, l -tocoferolo è ossidato a -tocoferol chinone, e ridotto a idrochinone, che è coniugato con acido glucuronico ed escreto nella bile. Con alta introduzione di vitamina, lidrochinone è degradato nel rene ad acido -tocoferonico, che è poi coniugato ed eliminato nellurina.

36 Funzioni La funzione dell -tocoferolo, il più efficace antiossidante liposolubile, è proteggere i fosfolipidi dal danno ossidativo. La varietà dei sintomi da deficienza ha portato a suggerire ruoli più specifici, nel metabolismo degli acidi nucleici e mitocondriale e nel mantenimento dellintegrità della membrana. Tuttavia, mancano prove conclusive per una funzione non antiossidante e lordine delle attività antiossidanti dei tocoferoli ( > > > ) è lo stesso di quello delle loro attività biologiche

37 Deficienza di vitamina E Nei roditori la carenza nutrizionale di vitamina E porta a sterilità, debolezza e atrofia muscolare Nei ratti maschi si ha ridotta motilità degli sperma- tozoi e degenerazione dellepitelio germinale; nelle femmine lunghi periodi di gestazione o riassorbimento dei feti e lesioni vascolari della placenta Si osserva paralisi muscolare e creatinuria indice di lesioni muscolari. I muscoli scheletrici e cardiaci diventano ischemici e presentano depositi di calcio. Gli eritrociti sono più suscettibili allemolisi Poiché la vitamina E è presente in diversi alimenti, è immagazzinata nel corpo ed il suo turnover è lento, la sua deficienza è osservata raramente nelluomo. Essa si verifica nei prematuri, poiché la vitamina è trasferita al feto solo negli ultimi due mesi della vita fetale, e in pazienti con malattie che causano riduzione dellassorbimento dei grassi

38 VITAMINA C Lacido ascorbico (AscH 2 ) è una vitamina per primati, pipistrello, porcellino dIndia, alcuni uccelli e pesci Nelle altre specie è un intermedio nella via del gulono-lattone, la principale via del catabolismo dellacido glucuronico (derivato del glucosio per ossidazione del gruppo –CH 2 OH a gruppo -COOH) La reazione di formazione dellAscH 2 è catalizzata dalla gulonolattone ossidasi, che manca nelle specie per le quali AscH 2 è una vitamina. Lo scorbuto (dovuto a carenza di vitamina C), è noto da secoli Esso insorgeva durante viaggi per mare, guerre e carestie, quando mancavano cibi freschi e particolarmente frutta e verdura. Il premio Nobel fu attribuito (1937) a Szent-Gyorgyi, che isolò un riducente, poi chiamato acido ascorbico per lattività anti-scorbuto

39 Biodisponibilità AscH 2 è abbondantemente diffuso negli alimenti di origine vegetale, e solo un loro basso consumo può portare a deficienza I fumatori sono a maggior rischio di carenza poiché in essi il catabolismo di AscH 2 è 2 volte più alto.

40 Assunzione di vitamina C La richiesta minima di AscH 2 è stabilita, ma vi è disaccordo per le razioni raccomandate (valori varianti fra 30 e 80 mg per giorno) La minima richiesta di AscH 2 fu stabilita dallo studio di Sheffield (1940), che mostrò che una dose < 10 mg preveniva lo scorbuto, o ne curava i segni clinici Con queste dosi non è ottimale la guarigione delle ferite, che richiede dosi di mg Con assunzioni inferiori, i livelli ematici di AscH 2 sono molto bassi Aumentando lassunzione, i livelli aumentano raggiungendo un plateau di moli/l (dosi tra mg), quando è raggiunta la soglia renale e AscH 2 è escreto

41 Dose raccomandata Alcuni ricercatori ritengono che le richieste siano molto più alte di mg, tuttavia dosi maggiori aumentano lescrezione urinaria di AscH 2 non metabolizzato, suggerendo saturazione delle riserve tessutali.

42 Assorbimento Nel ratto lassorbimento di AscH 2 è passivo, nelluomo e porcellino dIndia è Na-dipendente (attivo) attraverso la membrana mucosale, e Na- indipendente attraverso quella basolaterale Il deidro-ascorbato (DHA) è assorbito passivamente nella mucosa intestinale ed è ridotto ad AscH - prima del trasporto attraverso la membrana basolaterale mediante un carrier non ancora noto AscH - e DHA ematici sono liberi o legati ad albumina

43 Trasporto nelle cellule Il trasporto nelle cellule di AscH 2 è attivo, quello di DHA è facilitato e ha velocità 20 volte più alta Il DHA usa i trasportatori del glucosio, di cui sono note 7 isoforme (GLUT1-5, SGLT1-2), differenti per affinità e distribuzione nei tessuti: GLUT1 e GLUT3 hanno affinità simile per DHA e glucosio; GLUT4 (sensibile allinsulina) affinità più bassa; GLUT2, GLUT5 e SGLT1 non trasportano il DHA, nessuno trasporta AscH 2

44 Ascorbato tessutale AA è concentrato nelle ghiandole surrenali e pituitaria. Il 70% dellAA ematico si trova nel plasma e nelle emazie. Il 30% è nei leucociti che lo concentrano volte rispetto al plasma I neutrofili attivati formano O 2 - ed altri ossidanti, che allesterno ossidano AA a DHA, che penetra allinterno ed è ridotto a AA dalla glutaredossina GSH-dipendente (riciclaggio di AA)

45 Metabolismo dellascorbato AscH -, donando un elettrone, forma il radicale mono- deidroascorbato che può subire disproporzionamento ad AscH - e DHA In molti tessuti è contenuta la monodeidroascorbato riduttasi, una flavoproteina che catalizza la riduzione del radicale a AscH - La maggior parte del DHA è ridotto a AscH - dalla deidroascorbato riduttasi GSH-dipendente

46 Destino metabolico dellascorbato DHA non ridotto è idratato ad acido dichetogluconico, che è decarbossilato a xilosio, che entra nel metabolismo dei carboidrati. Questo è il maggior destino metabolico di AscH - nelle specie per cui non è una vitamina e nella cavia Nelluomo è escreto nellurina invariato o come DHA e dichetogulonato AscH - e DHA sono filtrati, poi riassorbiti, mediante trasporto facilitato Na-dipendente. Quando la filtrazione supera la capacità di trasporto, AscH - è escreto nellurina in proporzione allintroduzione.

47 Funzioni metaboliche AscH 2 aumenta lattività di enzimi in vitro (come altri riducenti) Ha ruoli specifici nelle idrossilasi contenenti Cu e quelle contenenti Fe legate al 2-ossiglutarato. E richiesto per lattività di idrossilasi, che catalizzano reazioni in cui lidrossilazione è legata alla decarbossilazione. La prolina idrossilasi è attiva in assenza di AscH 2 ma la velocità della reazione diminuisce dopo cicli, quando Fe nel sito catalitico è stato ossidato a Fe 3+. Lattività è ripristinata solo da AscH 2 che riduce Fe 3+ a Fe 2+. Mancando AscH 2 in vivo, la ridotta attività di prolina e lisina idrossilasi porta a insufficiente idrossilazione del collagene, il cui risultato è scarsa cicatrizzazione delle ferite e fragilità dei vasi sanguigni.

48 Influenza lassorbimento di Fe mantenendolo come Fe 2+ e chelandolo. Leffetto, che è dato da altri riducenti, si verifica quando AH è presente insieme con il pasto. AscH 2 reagisce con nitrito e altri reagenti nitrosanti in vitro, formando NO, ossido nitroso e N 2. Questo può prevenire la formazione di nitrosamine cancerogene per reazione tra nitrati ed amine presenti nel cibo al pH acido dello stomaco. Anche questo effetto è dovuto a AscH 2 presente nello stomaco insieme con nitriti ed ammine degli alimenti. La deplezione di composti nitrosanti in condizioni anaerobiche, può non verificarsi in ambiente aerobico. NO reagisce con O 2 formando N 2 O 3 e N 2 O 4 che sono agenti nitrosanti e possono reagire con AscH 2 formando NO e monodeidroascorbato. E così pos- sibile che AH sia esaurito senza alcun effetto significativo sulla concentrazione totale delle specie nitrosanti. Rimane da determinare se AscH 2 ha un qualsiasi effetto significativo nel ridurre i rischi della formazione di nitrosamine e della carcinogenesi.

49 Proprietà antiossidanti HA può prevenire il danno ossidativo alle proteine cellulari e allesterno può proteggere dai radicali ROO da cui è ossidato per primo nel plasma, ma non è noto se questo si verifica in vivo. HA in preparati di LDL, esposti a ROO, ONOO - o neutrofili at- tivati, inibisce laccumulo di prodotti della perossidazione spazzando radicali idrosolubili o rigenerando l -tocoferolo. HA inibisce in vitro lossidazione delle LDL dipendente da mio- globina, ma aumenta quella catalizzata da Fe, ripristinando Fe 2+ : Le due azioni potrebbero essere dovute alleffetto di differenti concentrazioni di HA sul rapporto Fe 2+ /Fe 3+ (gli effetti proossi- danti sono favoriti da alte concentrazioni di HA). Linibizione dellossida- zione delle LDL è uno dei meccanismi con cui HA mantiene bassa la pressione sanguigna: NO porta a rilassamento delle fibrocellule dei va- si e vasodilatazione. Questa non si osserva nello stress ossidativo per produzione di O 2 -, che inattiva NO, formazione di LDL os- sidate, che possono inibire sintesi e rilascio di NO dalle cellule endoteliali o attenuare la sua attività biologica, ossidazione di tioli intracellulari (GSH), che stabilizzano NO mediante forma- zione di S-nitrosotioli (GSNO). NO può essere preservato da AH, inibendo la formazione di Ox-LDL, spazzando O 2 -, risparmian- do i tioli, favorendo il rilascio di NO da S-nitrosotioli, e preser- vando cofattori della NOS endoteliale (la tetraidrobiopterina).

50 Deficienza da vitamina C Sebbene AA sia concentrato in molti tessuti, i depositi tessutali sono facilmente esauriti. Lind (1753), riportò linizio dello scorbuto in marinai dopo 45 giorni di navigazione. I primi sintomi sono debolezza, affaticamento, astenia e stanchezza. Seguono emorragie nella cute, nel sottocutaneo, nella mucosa gengivale, nelle cavità sierose e nei muscoli. Lo scorbuto non trattato è fatale, e sebbene sia ora raro, la deficienza subclinica di AA può essere comune, specialmente perché i primi sintomi di deficienza sono irrilevanti e non specifici.

51 Effetti di alti dosi di vitamina C Alti dosi di AscH 2 sono state raccomandate per la prevenzione e il trattamento del raffreddore, ma le prove ottenute in tentativi controllati non sono convincenti. Molte persone prendono fra 1-5 g al giorno di AscH 2 La mancanza di effetti tossici è dovuto al fatto lescrezione di AscH 2 aumenta con lassunzione, ma mancano prove che queste assunzioni siano benefiche. La vitamina C può essere tossica in particolari condizioni. In casi di sovraccarico di Fe, quali si verificano in pazienti con talassemia maior, emocromatosi, ed anemia sideroblastica, un aumento della introduzione di vitamina C, che favorisce lassorbimento di Fe può essere dannoso

52 CAROTENOIDI I carotenoidi sono un gruppo di circa 600 pigmenti (idrocarburi, caroteni, o composti idrossilati, xantofille) a 40 atomi di C. La estesa delocalizzazione elet- tronica, dovuta ai doppi legami alternati, fa sì che i carotenoidi assorbano nel visibile. I caroteni sono isomeri geome- trici (cis o trans) o strutturali (differenze nelle parti termina- li). I caroteni più comuni hanno 11 doppi legami in catena linea- re (licopene) o 9 in catena linea- re e 2 negli anelli laterali ( -ca- rotene), per cui presentano dif- ferenze nellassorbimento della luce. I pomodori (licopene)sono rossi e le carote ( -carotene ) arancione. Nel licopene e -carotene esibi- scono simmetria molecolare in- terna e la scissione centrale del -carotene genera due molecole di retinolo. Interconversione delle forme geometriche si ha per esposizione a luce e calore o per reazioni chimiche, ma alla fine è assunta la forma trans a più basso stato di energia perché limpedimento sterico è minimo. Un legame cis causa una notevole variazione nella forma della molecola, che ha un ruolo nelle piante e con i metaboliti del -carotene. Isomeri geometrici del -carotene nel plasma sono il 9-cis- -carotene e il 13-cis- -carotene.

53 Biodisponibilità I carotenoidi (Car) derivano da verdure e frutta pigmentati (carote, patate dolci, albicocche, spinaci), in cui vi è variabilità di contenuto col clima e la maturazione (il rapporto fra -carotene e -criptoxantina negli agrumi cambia con la maturazione). Il contenuto in sorgenti di origine animale (latticini e tuorlo duovo) cambiano con la nutrizione degli animali. Cottura e lavorazione del cibo influenzano il contenuto dei Car, che hanno gradi diversi di stabilità. I metodi di cottura casalinghi non alterano drasticamente il contenuto di Car nei vegetali. Il trattamento a medio calore provoca una perdita dell8-10% di - ed -carotene di vegetali giallo-arancio (carote, patate dolci e zucca), e del 60% delle xantofille e del 18-25% di luteina in vegetali verdi (cavolini di Bruxelles e cavoli verdi). Il calore provoca una transizione trans-cis, che dipende da durata e temperatura del trattamento. Patate dolci, carote e pomodori freschi contengono quantità trascurabili di cis- -carotene, che aumentano con la cottura. Lesposizione ad un eccessivo trattamento termico può provocare la ossidazione dei Car, con variazioni strutturali che diminuiscono lattività di vitamina A del cibo e alterano altre proprietà biologiche dei Car.

54 Assorbimento Assorbimento e metabolismo dei Car variano con la specie. Nelluomo e altri mammiferi (alcuni primati, furetto, ecc.), quantità discrete sono assorbite dalle cellule mucosali e appaiono nel circolo e nei tessuti. Nei roditori ed altri animali a grasso bianco i Car sono metabolizzati a vitamina A nelle cellule mucosali, per cui con- centrazioni ematiche e tessutali sono basse rispetto alluomo. Nelluomo una quantità variabile di Car è metabolizzata nelle cellule mucosali durante lassorbimento. La percentuale di Car assorbiti è bassa (10-30%), e diminuisce aumentando lingestione. I grassi influenzano lassorbimento poiché i Car sono assorbiti in presenza di micelle di sali biliari e i grassi stimolano la secrezione della bile. Lassorbimento negli enterociti si verifica per diffusione passi- va e i carotenoidi non metabo- lizzati sono incorporati nei chi- lomicroni e secreti nella linfa. Studi su uomo e animali dimo- mostrano che, come per la so- lubilizzazione dei carotenoidi nelle micelle, lefficienza della incorporazione nei chilomicro- ni e il trasporto nella linfa e nel sangue dipendono dalla polarità dei carotenoidi.Lassorbimento di una xantofilla, che è vicina alla superficie delle micelle è più probabile di quello di un carotene che è nel core delle micelle

55 Distribuzione ai tessuti I carotenoidi sono presi dal fegato dopo degradazione delle lipo- proteine da parte della lipasi delle lipoproteine (LPL). I residui dei chilomicroni sono rimossi dal sangue mediante i recettori dei chilomicroni. I carotenoidi possono essere ri- lasciati dal fegato nel circolo in VLDL e poi associate a LDL. Il plasma umano contiene una frazione dei carotenoidi alimen- tari. Il tessuto adiposo (per il suo volume) ed il fegato sono i più importanti tessuti di deposi- to dei carotenoidi, ma questi so- no stati trovati anche nei polmo- ni, nel rene, nella prostata e in altri tessuti. I carotenoidi si dispongono nelle membrane vicino ai lipidi. I caroteni idrofobici (licopene e -carotene) si dispongono nel core in posizione parallela alla superficie della membrana. Le xantofille si orientano verso la superficie delle membrane dove possono esporre le porzioni polari allambiente acquoso e possono essere aumentate le associazioni con le proteine. I diossicarotenoidi si orientano in posizione perpendicolare alla superficie della membrana.

56 Azioni primarie dei carotenoidi Dipendono dal sistema di doppi legami coniugati. Assorbimento della luce visibile ed ultravioletta. La sola funzione nota di tale assorbimento è legata allaccumulo di zeaxantina e luteina, nella regione della macula della fovea centralis nella parte posteriore della retina.. Queste xantofille gialle assorbono luce blu prima che colpisca i coni e possono attenuare la risposta alla luce. Così possono diminuire laberrazione cromatica associata alla luce blu. Essi potrebbero anche agire come antiossidanti proteggendo questa regione della retina dal danno fotoossidativo. Trasferimeno di energia. I carotenoidi di piante verdi, alghe e batteri fotosintetici possono accettare o donare energia elettroni- ca, iniziata dallas- sorbimento della lu- ce, attraverso trasfe- rimento di energia singoletto o tripletto. Nel primo caso, Car funzionano come an- tenne assorbendo lu- ce visibile a lunghezze donda che non possono essere assorbite dalla clorofilla e formano carotenoidi eccitati singoletto ( 1 Car). Lenergia luminosa è poi trasferita alla clorofilla formando cloro- filla eccitata allo stato singoletto, coinvolta nella fotosintesi. Nel processo, i Car agiscono come pigmenti accessori, permettendo che la fotosintesi si verifichi in un ampio campo di lunghezze donda nel visibile.

57 I Car proteggono le piante da reazioni fotochimiche nocive, e luomo da disturbi (porfirie sensibili alla luce) in cui vi è sovrap- produzione di protoporfirina IX, un forte fotosensibilizzatore. I sensibilizzatori (Sen) sono eccitati dalla luce a specie singoletto ( 1 Sen) che sono convertite a specie tripletto ( 3 Sen), che iniziano reazioni radicaliche nocive. 3 Sen sono disattivati per trasferimen- to di energia ai carotenoidi che danno carotenoidi tripletto ( 3 Car). A causa della catena polienica, i 3 Car dissipano leccesso di energia come calore e riformano lo stato basale. I Car possono anche spegnere 1 O 2. Nel processo è rigenerato 3 O 2 ed il 3 Car formatosi perde lenergia come calore. Non è noto se questa azione è importante in vivo, sebbene 1 O 2 si formi durante la perossidazione lipidica. Reazioni con specie radicaliche. In vitro il -carotene inibisce la perossidazione in semplici sistemi lipidici a bassa, ma non ad alta, concentrazione di O 2, ma non protegge le LDL a qualsiasi concentrazione di O 2. In vitro i carotenoidi spazzano radicali liberi e le alte k delle reazioni con gli ROO suggerisce che tali reazioni possano verificarsi nelle membrane proteggendo i PUFA. Non è noto se i Car svolgano un ruolo antiossidante in vivo.

58 COMPOSTI FENOLICI I polifenoli sono una delle più abbondanti categorie di composti presenti nei vegetali I fenoli alimentari comprendono: acidi fenolici, tannini idrolizzabili, tannini condensati, caffeati, lignani, flavonoidi e altri composti. I fenoli semplici sono composti con singolo anello aromatico ed uno o più gruppi -OH (acido caffeico ed acido gallico). I polifenoli sono composti con diversi anelli fenolici. Fra essi i flavonoidi hanno una struttura a tre anelli. I tannini, sostanze usate per la concia delle pelli, sono estratti delle piante contenenti una miscela complessa di composti polifenolici ad alto peso molecolare. Essi sono poliesteri di zuccheri con acido gallico e sostanze simili. Tannini condensati sono miscele di polimeri di flavonoidi e tannini idrolizzabili.

59 Attività antiossidanti dei polifenoli Gran parte degli antiossidanti dei vegetali sono polifenoli i cui gruppi -OH spazzano ROO, formando radicali fenossilici poco reattivi. Lattività antiossidante dipende dal numero di -OH sui singoli anelli benzenici, e da quello totale. I polifenoli agiscono anche chelando ioni metallici Molecole derivanti dal pirogallolo (acido gallico e derivati) hanno attività più alte di quelle derivanti dal catecolo (acido caffeico e derivati). Composti con porzioni di catecolo alle estremi- tà (acido rosmarinico) inibiscono la perossidazione più di altri derivati del catecolo. Le attività di ana- loghi con gruppi alcossilici al posto di gruppi idrossilici sono generalmente basse.

60 FLAVONOIDI Szent-Gyorgi (1936) trovò che estratti di pepe rosso e di succo di limone erano efficaci nel trattamento di pazienti con aumentata permeabilità e fragilità dei capillari. Il materiale isolato dal limone (citrina) diminuiva le emoraggie dei tessuti e prolungava la vita dei porcellini dIndia affetti da scorbuto. La citrina è una miscela di flavonoidi, per i quali si propose il nome vitamina P per la presunta azione sulla permeabilità vascolare. I flavonoidi naturali sono un gruppo di sostanze fenoliche (più di 4000) trovate nelle piante. I flavonoidi sono costituita da due gruppi benzenici connessi da un ponte a tre ato- mi di carbonio. I flavonoidi sono suddivisi in sottoclassi: antocianidine, flavoni, flavononi, flavo- noli, flavanoli ed i loro precursori meta- bolici, i calconi. Con leccezione dei calconi, i flavonoidi degli alimenti hanno un anello piranico (anello eterociclico contenente O), che è formato dalladdizione dellO 2 alla posizione 2 dei calconi e successiva ciclizzazione della catena a tre atomi di carbonio con lanello A.

61 Struttura dei flavonoidi Flavanoli: basso stato di ossidazione, anello pira- nico saturato, -OH in posizione 3 (flavan-3-oli o catechine). Flavoni: doppio legame sui C2,3 e cheto-gruppo su C4. Flavonoli: flavoni idrossilati in posizione 3 (3- OH flavoni). Flavanoni: non hanno il doppio legame sui C 2,3 Isoflavani e isoflavoni: anello B in posizione 3. Le antocianidine: due doppi legami e carica positiva su O nellanello C

62 I flavonoidi hanno -OH nelle posizioni 4, 5, 7. I diversi composti differiscono per le altre sostituzioni. La quercetina (3,5,7,3,4-pentidrossiflavone) è un flavonolo con un -OH in posizione 3; contenuto nei broccoli, nelle cipolle, nella lattuga. La catechina (3,5,7,3,4-pentaidrossi-flavan) è un flavan-3-olo (flavanolo) con -OH in posizione 3; contenuto in alte concentrazioni nel vino rosso. I flavonoidi si trovano come glicosidi, con glucosio, galattosio, ramnosio. I glicosidi delle antocianidine (antocianine) sono pigmenti idrosolubili (rossi, blu, porpora, viola) di fiori, frutta (uva, ciliegie, more, lamponi, fragole, mirtilli) e di ortaggi (melenzane, cavoli). I glicosidi di altri flavonoidi (antoxantine) sono meno colorate.

63 Imbrunimento enzimatico Imbrunimento enzimatico è la trasformazione di composti fenolici in polimeri colorati, di solito bruni o neri. Sembra che un enzima catalizzi lidrossilazione e lossidazione. Enzimi di diversa origine hanno rapporti fra attività idrossilante e ossidante diversi per lesistenza di isoenzimi o il tenore in Cu + e Cu 2+. Si parla di monofenolasi o di cresolasi per la prima tappa e di polifenolossidasi o catecolasi per la seconda. I chinoni reagiscono con H 2 O dando triidrossibenzeni, che reagi- scono con altri chinoni formando idrossichinoni, che subiscono condensazione ossidativa formando polimeri pigmentati (melanine) bruni o neri. Limbrunimento si verifica nei vegetali (ma non in alimenti ani- mali), ricchi di composti fenolici, negli insetti (imbrunimento della cuticola) e nei mammiferi (melanomi responsabili della pigmentazione della pelle). Pone problemi di colore in frutta (mele, pere, albicocche, pesche, banane) e verdura (patate, funghi), quando i tessuti sono malati o danneggiati da contusioni o da trattamenti (pelatura, taglio, triturazione, congelamento, disidratazione). Enzimi e substrati sarebbero localizzati in compartimenti distinti, separati da membrane. Nella mela vi è un enzima solubile ed uno legato ai cloroplasti. Limbrunimento è ricercato nella maturazione dei datteri, nella preparazione del sidro, nella fermentazione del té, nellessicca- mento del tabacco e dei semi di cacao. I polimeri ostacolano la penetrazione dei microrganismi e la loro proliferazione.

64 Biodisponibilità Molti frutti, vegetali e bevande contengono flavonoidi. Vi è un numero limitato di flavonoidi, di ciascuna sottoclasse, che abbondano in alimenti vegetali consumati : 3 antocianidine (cianidina, delfinidina, malvidina), 3 flavanoli (catechina, epicatechina, epigallocatechina), 2 flavononi (esperetina, naringenina), 2 flavoni (apigenina, luteolina), 3 flavonoli (chempferolo, miricetina, quercetina) e 3 calconi. Negli alimenti alte concentrazioni si trovato nei tessuti esterni colorati come bucce, pelle e strato esterno di frutta e vegetali. Una quantità significativa penetra nel corpo umano con bevande come il tè, caffè, cacao, vino e birra. Le antocianine commerciali, usate come additivi coloranti, provengono quasi tutte dalle bucce delluva, come sottoprodotto dellindustria del vino.

65 Assorbimento Vi sono dubbi sullassorbimento dei flavonoidi della dieta (1 g). Poiché la solubilità nelle micelle è importante per lassorbimento, si riteneva che i glicosidi idrofilici fossero difficilmente assorbiti. In realtà il tipo di zucchero legato è determinante per lassorbimento e i glicosidi devono essere preventivamente idrolizzati affinché i flavonoidi siano assorbiti nel circolo. L idrolisi è catalizzata dalla lattasi florizina idrossilasi (LPH), e laglicone penetra nellepitelio per diffusione passiva. Alcuni glicosidi penetrano nellepitelio mediante il carrier dei glucidi Na-dipendente (SGLT1), e sono idrolizzati da una - glicosidasi citosolica (GBG). Glicosidi non assorbiti e non idrolizzati da LPHL (i rutinosidi) sono deglicosilati da enterobatteri nel colon.

66 Assorbimento e metabolismo dei flavonoidi La microflora trasforma anche gli agliconi in vari me- taboliti derivati dalla scissione dellanello eterociclico e dellanello A e degradazione in acidi fenolici. Questi sono in genere escreti nellurina e, come i fla- vonoidi, possono essere coniugati a prodotti glucuro- nati o metilati I metaboliti assorbiti penetrano nel fegato e sono ulteriormente coniugati. I metaboliti risultanti sono escreti nel lume intestinale o entrano in circolo Assorbimento, immagazzinamento ed escrezione dei flavonoidi sembrano essere molto simili a quelli della vitamina C.

67 Effetti biologici I flavonoidi hanno attività biologiche, che potrebbero essere legate in gran parte a proprietà antiossidanti I flavonoidi inibiscono vari enzimi (xantina ossi- dasi, NADPH ossidasi, lipossigenasi, fosfolipasi A 2 ). I flavonoidi spazzano radicali dellO 2, donando un H o un elettrone, con una efficienza direttamente legata al grado di idrossilazione Lattività antiossidante dipende dal pH, il cui aumento provoca dissociazione degli -OH fenolici e aumento della loro capacità di donare elettroni Alcuni flavonoidi (e polifenoli) inibiscono la perossi- dazione donando rapidamente un H a ROO : Il fenossil radicale (PP ) si stabilizza donando un altro H e formando un chinone, o reagendo con un altro radicale La capacità dei favonoidi di spazzare radicali dipende loro potenziale di riduzione più basso di quello degli ROO. Alcuni flavonoidi agiscono chelando ioni metallici di transizione

68 Prevenzione degli effetti citotossici delle ox-LDL Laggregazione delle LDL è aterogenica poiché le LDL aggregate sono assorbite dai macrofagi a più alta velocità, portando a formazione delle cellule schiumose. I meccanismi dellaggregazione in vivo sono poco noti. Laggregazione indotta da agitazione deriva da interazione tra i domini idrofibici delle LDL, che sono esposti nellagitazione. I polifenoli, legandosi simultaneamente a più di una molecola sulla superficie delle LDL, riducono la loro suscettibilità alla aggregazione. Poiché lossidazione delle LDL porta alla loro aggregazione, questa è inibita inibendo lossidazione delle LDL. I flavonoidi inibiscono lossidazione delle LDL: Spazzando i radicali liberi; Proteggendo l -tocoferolo e i carotenoidi nelle LDL dallossidazione; Rigenerando l -toferolo dal tocoferil radicale; Chelando ioni dei metalli di transizione; Proteggendo le cellule dal danno ossidativo e, quindi, inibendo lossidazione delle LDL mediata da cellule.

69 Deficienza di bioflavonoidi La deficienza di bioflavonoidi negli animali porta ad aumentata permeabilità e fragilità capillare. Questo effetto sarebbe indiretto poiché i flavonoidi proteggono Asc chelando cationi metallici. La sindrome da deficienza non è stata vista nelluomo e non vi è prova di una richiesta di flavonoidi nella nutrizione umana. I flavonoidi sono stati usati nel trattamento di malattie in cui è coinvolta lanormalità vascolare è un fattore. Alcuni flavonoidi inibiscono laldosi riduttasi, coinvolto nella formazione delle cateratte nel diabete e nella galattosemia, ma non è provato che essi inibiscono le cataratte nelluomo.

70 SELENIO Il selenio (Se) è un metalloide con proprietà simili allo zolfo, che si trova nel gruppo VIA della tavola periodica tra zolfo e tellurio. Forma ossidi (SeO 2 ), ossiacidi (H 2 SEO 4 ), sali (seleniuri, seleniti e selenati) e composti corrispondenti ad aminoacidi o proteine contenenti zolfo. Disponibilità Se (elemento raro) è presente in piccole quantità sulla crosta terrestre, anche se vi sono aree in cui la concentrazione è alta. Nei tessuti animali e vegetali si trovano bassi livelli di Se. Quelli nei vegetali riflettono la concentrazione del Se nel suolo e sono variabili anche in un singolo paese. Le forme di Se negli alimenti sono seleniometionina, (piante), e seleniocisteina (animali). Se inorganico si trova nei supplementi.

71 Assorbimento Sono riportati i livelli totali del Se negli alimenti, e pur essendo assorbimento e utilizzazione collegate ai composti consumati i dati sui livelli di questi sono pochi. Nelluomo Se è assorbito nellintestino tenue, e le forme organiche sono assorbite maggiormente (più del 90% della selenometionina e il 60% del seleniuro). Lassunzione è influenzata da: presenza di vitamine A, E e C, ed è più alta se Se è presente nel cibo che nei supplementi. Se inorganico è trasportato passivamente attraverso lorletto a spazzola in competizione con lo zolfo inorganico. La selenio-metionina è trasportata attivamente dal sistema della metionina È probabile che la seleniocisteina sia assorbita in modo simile.

72 Metabolismo ed escrezione Se è trasportato nel sangue legato a proteine ed è depositato in diversi tessuti dove i suoi livelli dipendono dalla quantità e dalla forma chimica I livelli sono più alti in fegato e rene con una dieta ricca, e nel rene con una dieta povera. A causa della massa totale, i muscoli contengono la maggiore quantità di Se Parte di Se ingerito, dopo riduzione a seleniuro, è metilato, (di- e trimetilseleniuro), processo importante per la detossificazione. Gran parte di Se è incorporato in proteine: non speci- fiche, con Se-metionina e Se-cisteina al posto degli analoghi solforati, o contenenti Se-cisteina specifiche per Se come GPX e le deiodinasi delle iodotironine. Le deiodinasi sono selenoproteine non antiossidanti coinvolte nel metabolismo delle iodotironine. Il selenio è escreto mediante tre vie: nelle urine, nella forma di ione trimetilselenonio; nelle feci, come selenio dietetico non assorbito in secrezioni biliari, pancreatiche ed intestinali; nellaria espirata, come dimetilseleniuro volatile.

73 Sindrome da deficienza Dal 1957 si scoprì che Se previene diverse malattie negli animali. La deficienza di Se è responsabile di malattie nelluomo, come la malattia di Keshan, una cardiomiopatia di bambini o donne in età feconda, che è epidemica dove il suolo è povero di Se. Esperimenti (più di 1,5 milioni di bambini) dimostrarono che Se previene la malattia, anche se non è lunico fattore coinvolto. Studi in regioni endemiche della Cina trovarono che quando i supplementi erano dati a persone prive naturalmente di selenio, la cui replezione era seguita per diversi mesi, lattività del GPX raggiungeva un plateau a livelli simili per uomini che ricevevano una dose di 40 g/giorno (richiesta fisiologica). La funzione della tiroide dipende da Se. Il cretinismo mixode-matoso (regioni di gozzo endemico nellAfrica tropicale) è collegato a deficienza di Se e I 2. La Finlandia ha stabilito per legge laddizione di Se a tutti i fertilizzanti, per aumentarne lassunzione.

74 Tossicità La tossicità di Se (selenosi), per eccessiva assunzione è ben nota negli animali, meno nelluomo. Essa si è verificata su larga scala in regioni selenifere della Cina dove sono consumati cibi contaminate da selenio e si è trovata in soggetti che consumavano quantità eccessive di supplementi di Se. I sintomi più comuni sono perdita dei capelli e delle unghie e deformità. Sono state anche riportate lesioni alla pelle, neuropatie periferiche, diarrea, fatica, irritabilità ed odore simile allaglio nel respiro e nelle secrezioni corporee. Studi in Cina suggeriscono che circa 4-5 mg/giorno sono tossici. LAgenzia della protezione ambientale degli USA ha proposto una dose orale di 5 g/ kg di peso corporeo (0,35 mg pro die per un uomo di 70 kg).

75 Antiossidanti negli alimenti Gli antiossidanti nel cibo sono importanti per almeno 4 motivi: Proteggono i componenti del cibo. Spezie ricche di antiossidanti sono usate da secoli per ritardare il deterioramento degli alimenti. Oggi, si usa lintegrazione del bestiame con vitamina E per il mantenimento della carne, sono usati antiossidanti sintetici (butilato idrossitoluene, BHT, butilato idrossianisolo, BHA, propil gallato) e si cerca di sostituirli con antiossidanti naturali. Alimenti Antiossidanti sintetici grassi ed oli per frittura, strutto, olio di pesce, grasso di bovini pollame ed ovini destinato alle margarine, preparazioni per torte, spuntini a base di cereali, latte in polvere per distributori automatici, zuppe e brodi disidratati, salse, frutta a guscio lavorata, condimenti ed insaporitori, cereali precotti, patate granulate e disidratate, gomme da masticare, integratori dietetici. Vitamina Cbirra, funghi secchi, gelatine, confetture, mar- mellate, liquori, insaccati, patate crude affettate, frutta sciroppata, prodotti dolciari, carne fresca, succhi di frutta, prodotti della pesca, sottaceti, vino e farine. Vitamina Egrassi emulsionati, olii, insaccati freschi

76 Possono esercitare effetti benefici senza essere assorbiti. Molti cibi e la saliva contengono NO 2 -, usato nella conservazio- ne della carne poiché esso e gli ossidi di azoto sono battericidi. NO previene lirrancidimento spazzando i radicali ROO e impedendo il rilascio di Fe 2+ dalle emoproteine (mioglobina). NO 2 - nello stomaco forma HNO 2 che si decompone a N 2 O 3 e può condurre a nitrosazione di ammine, nitrazione di composti aromatici e deaminazione di basi del DNA (guanina). Questi pro- cessi sono inibiti, con effetto gastroprotettivo e forse anticancerogeno, dai fenoli di vegetali, frutta, vino ed altre bevande più di HA. I fenoli non assorbiti vanno nel colon, dove la loro capacità di chelare Fe, non assorbito nel tenue, e spazzare le ROS può essere benefica nel caso di transitori aumenti della pO 2 che favoriscono la generazione Fe-dipendente di ROS da parte delle feci. Diversi flavonoidi inibiscono ciclossagenasi e lipossigenasi, che possono essere importanti nello sviluppo del cancro del colon.

77 Sono componenti di estratti di piante che hanno effetti tera- peutici (antinfiammatorio, antischemico, e antitrombotico). Un estratto della pianta ornamentale Ginkgo biloba è stato usato nella medicina naturale per secoli. Lestratto esibisce in vitro pro- prietà antiossidanti, che sembrano dovute ai flavonoidi presenti (rutina, quercetina e mirecitina). Le medicine tradizionali Kampo sono estratti di diverse erbe e contengono una miscela di fenoli ed altri composti, compresa la glicirizina derivante dalle radici della pianta della liquirizia, Glycyrrhiza glabra. Gli estratti di propoli, una sostanza resinosa raccolta dalle api, contenente composti fenolici, sono stati spesso usati in medicina. Con i metalli determinano la capacità dei meccanismi di difesa antiossidante cellulare. Alcuni importanti sistemi antiossidanti endogeni costituiti da vitamine hanno bisogno di elementi metallici come cofattori. Molte sostanze contenute negli alimenti e assorbite nel corpo hanno effetti benefici agendo come antiossidanti ( -tocoferolo e acido ascorbico). Nel tratto gastrointestinale delluomo esistono meccanismi specifici per lassorbimento dello HA. Si verifica lassorbimento di tutti i tocoferoli presenti nella dieta, ma il fegato secerne selettivamente l -tocoferolo. Si accumulano crescenti prove dellassorbimento di altri fenoli delle piante. Per esempio, quercitina e catechine sono assorbite allo stesso grado nelluomo. Esse ed i loro metaboliti possono raggiungere livelli ematici 0,1-1 M, che, in vitro, ritardano la perossidazione lipidica in liposomi, microsomi e LDL.

78 CONCLUSIONI La escursione sul tema dei radicali liberi, dei loro effetti dannosi, e delle strategie per combatterli, può essere conclusa rilevando che i dati a nostra disposizione indicano che indiscriminate e protratte somministrazioni di alte dosi di vitamine o di sali minerali possono risultare inutili o controproducenti per il benessere dell'organismo in quanto la introduzione di nutrienti in pillole a volte fa bene, spesso è dannosa ed è sempre più costosa di una dieta ben equilibrata che tenga conto delle abitudini di vita e quindi delle esigenze dell'organismo Gli antiossidanti sono chiaramente importanti per la vita delluomo, ma essi non sono un elisir di lunga vita. Per quanto riguarda le diverse raccomandazioni dietetiche, in termini strettamente scientifici poco è stato provato. Tuttavia, molti anni di ricerche possono almeno servire a formarci unopinione applicabile al nostro stile di vita. In effetti una delle poche indicazioni che devono essere accolte è la necessità di adeguare lalimentazione alle necessità dellorga- nismo, non solo dal punto di vista energetico, ma anche dal punto di vista del mantenimento di un adeguato stato antiossidante


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