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EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF LIVER REDOX STATUS INDUCED BY ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY DURING HEPATIC SURGERY: ANALYSIS OF HEMATIC AND TISSUTAL PARAMETERS.

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1 EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF LIVER REDOX STATUS INDUCED BY ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY DURING HEPATIC SURGERY: ANALYSIS OF HEMATIC AND TISSUTAL PARAMETERS. Guzzetti E., Ferla F., Milani F., Accinni R., Aldrighetti L., Catena M., Ferla G. Liver Unit - Dipartimento di Chirurgia Istituto Scientifico San Raffaele Università Vita-Salute San Raffaele Milano

2 Controllo del sanguinamento intraoperatorio: occlusione intermittente del peduncolo vascolare epatico Trasfusioni intraoperatorie di emazie concentrate o plasma fresco congelato sono associate ad un peggioramento prognostico. 1, 2 Occlusione intermittente del peduncolo vascolare epatico (manovra di Pringle): chiusura con uno strumento emostatico dellintero ilo portobiliare (v.porta, a.epatica, via biliare) 1: Koobi DA, et al. Influence of transfusion on perioperative and long term outcone in patients following hepatic resection for colorectal metastases. Ann Surg 2003;237: : Wu CC, et al. Prediction and limitation of hepatic tumor resection without blood transfusion in cirrhotic patients. Arch Surg 1998;133:

3 Danno da ischemia e riperfusione (IR) Specie reattive dellossigeno Danno da ischemia e riperfusione: caratterizzato da sofferenza epatocitaria, attivazione delle cellule di Kupffer e infiltrazione leucocitaria epatica 3.Danno da ischemia e riperfusione: caratterizzato da sofferenza epatocitaria, attivazione delle cellule di Kupffer e infiltrazione leucocitaria epatica 3. Produzione di radicali liberi: specie reattive di ossigeno ed altri elementi in grado di danneggiare varie strutture cellulari (DNA, proteine, lipidi) 4.Produzione di radicali liberi: specie reattive di ossigeno ed altri elementi in grado di danneggiare varie strutture cellulari (DNA, proteine, lipidi) 4. Sistema antiossidante endogeno: molecole ed enzimi in grado di ridurre il danno indotto dai radicali liberi 5.Sistema antiossidante endogeno: molecole ed enzimi in grado di ridurre il danno indotto dai radicali liberi 5. 3: Jaeschke H Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003;284:G15-G26 4: Bayir H Reactive oxygen species. Crit Care Med 2005;33(12):S498-S501. 5: Glantzounis G, et al. The contemporary role of antioxidant therapy in attenuating liver ischemia-reperfusion injury: a review. Liver Transpl 2005;11:

4 Glutatione (GSH) (L- -glutamil-L-cisteinilglicina) Tripeptide tiolico dotato di sito attivo SH in cisteina che può essere ossidato e ridotto.Tripeptide tiolico dotato di sito attivo SH in cisteina che può essere ossidato e ridotto. Tra i suoi precursori abbiamo cisteina e cisteinil glicina 6.Tra i suoi precursori abbiamo cisteina e cisteinil glicina 6. GSSG2 GSH H2O2H2O2 2 H 2 O Glutatione Perossidasi (GPx) 2 NADP + + 2H + 2 NADPH Glutatione Reduttasi (GR) 6: Wu G, et al. Glutathione metabolsim and its implication for health. J Nutr 2004;134:

5 Studio Clinico Sperimentale SCOPO : studiare le variazioni dello stato redox cellulare, indotte dallinsulto ischemico-riperfusorio, analizzando le alterazioni del GSH e dei suoi precursori a livello tissutale epatico e a livello plasmatico. PAZIENTI : Totale: n°43. Gruppo P: n° 36 (occlusione del peduncolo vascolare eseguita) Gruppo P: n° 36 (occlusione del peduncolo vascolare eseguita) Gruppo NP: n°7 (occlusione del peduncolo vascolare non eseguita – controllo) Gruppo NP: n°7 (occlusione del peduncolo vascolare non eseguita – controllo)

6 MATERIALI E METODI: MODALITA DI CAMPIONAMENTO Campioni plasmatici – prelievo di 12 ml di sangue venoso con il seguente timing: T1: preoperatorio T1: preoperatorio T2: al termine dellintervento T2: al termine dellintervento T3: 1 a giornata postoperatoria T3: 1 a giornata postoperatoria T4: 4 a giornata postoperatoria T4: 4 a giornata postoperatoria Campionamento eseguito presso lU.F. di Chirurgia Generale Epatobiliare – Liver Unit (HSR) in collaborazione con il Dipartimento di Chirurga dellUniversità degli Studi di Milano (H.Sacco) Campioni tissutali - prelievo di biopsie epatiche con il seguente timing: T1: prima della fase ischemica T1: prima della fase ischemica T2: dopo 10 min. di ischemia T2: dopo 10 min. di ischemia T3: dopo 20 min. di riperfusione T3: dopo 20 min. di riperfusione

7 Campioni tissutali Cisteina (ridotta e totale)Cisteina (ridotta e totale) Cisteinil-glicina (ridotta e totale)Cisteinil-glicina (ridotta e totale) Glutatione (ridotto e totale)Glutatione (ridotto e totale) Attività dellenzima Glutatione perossidasiAttività dellenzima Glutatione perossidasi Attività dellenzima Glutatione reduttasiAttività dellenzima Glutatione reduttasi Campioni plasmatici CisteinaCisteina Cisteinil-glicinaCisteinil-glicina GlutationeGlutatione Attività dellenzima Glutatione perossidasiAttività dellenzima Glutatione perossidasi Attività dellenzima Glutatione reduttasiAttività dellenzima Glutatione reduttasi MATERIALI E METODI Analisi eseguite presso il Laboratorio di Biochimica Clinica – Istituto di Fisiologia Clinica CNR (H.Niguarda)

8 RISULTATI: CARATTERISTICHE DELLA POPOLAZIONE Variabile Gruppo P Gruppo NP N° pazienti 367 Età media (range) [anni] 54 (30-79) 54 (26-83) Sesso (maschi/femmine) [n] 18/184/3 Diagnosi [n] Metastasi da neoplasia del colon Metastasi da neoplasia del colon172 Epatocarcinoma Epatocarcinoma92 Neoplasie della colecisti Neoplasie della colecisti22 Iperplasia nodulare focale Iperplasia nodulare focale11 Metastasi non da neoplasia del colon Metastasi non da neoplasia del colon2 Colangiocarcinoma Colangiocarcinoma3 Emangioma Emangioma2 Concomitante epatopatia [n] Fegato sano/HCV/pregressa CT Fegato sano/HCV/pregressa CT26/2/83/2/2

9 RISULTATI: RESEZIONI EPATICHE Variabile Gruppo P Gruppo NP Procedura chururgica principale [n] Epatectomia destra Epatectomia destra142 Segmentectomia Segmentectomia64 Nodulectomie multiple <5 Nodulectomie multiple <511 Bisegmentectomia Bisegmentectomia7 Epatectomia sinistra Epatectomia sinistra5 Mesoepatectomia Mesoepatectomia2 Epatectomia destra estesa al IV segm. Epatectomia destra estesa al IV segm.1 Tipo di resezione [n] Maggiore/Minore Maggiore/Minore Anatomica/Non Anatomica Anatomica/Non Anatomica Singola/Multipla Singola/Multipla22/1433/330/62/54/35/2 Durata media del clampaggio (range) [min.] 39 (10-86) -

10 RISULTATI: OUTCOME PERIOPERATORIO Variabile Gruppo P Gruppo NP Perdite ematiche medie (range) [ml] Trasfusioni di EC intraoperatorie [U] 460 ( ) ( ) 400 ( )1 Indici biochimici di funzionalità epatica Picco ALT [media(ds)] U/L Picco ALT [media(ds)] U/L 493 (427) 358 (256) Picco AST [media(ds)] U/L Picco AST [media(ds)] U/L 503 (405) 351 (226) Picco bilirubina totale [media(ds)] mg/dl Picco bilirubina totale [media(ds)] mg/dl 1,42 (0,87) 2,06 (1,07) Picco PT-INR [media(ds)] Picco PT-INR [media(ds)] 1,24 (0,21) 1,17 (0,13) Complicanze postoperatorie [n] Fistola biliare Fistola biliare Insufficienza epatica Insufficienza epatica Versamento pleurico Versamento pleurico Infezione polmonare Infezione polmonare Emorragie Emorragie Fibrillazione atriale Fibrillazione atriale Degenza postoperatoria media (range) [gg] 13,7 (5-66) 8,4 (6-16) Mortalità postoperatoria --

11 DATI BIOCHIMICI Come varia la concentrazione degli antiossidanti tiolici in seguito a danno ischemico-riperfusorio?

12 RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE Riduzione delle concentrazioni tissutali di glutatione e dei suoi precursori Riduzione delle concentrazioni tissutali di glutatione e dei suoi precursori Gruppo P Gruppo NP

13 Come varia lo stato ossidoriduttivo degli antiossidanti tiolici in seguito a danno ischemico-riperfusorio?

14 Nel gruppo P miglioramento del rapporto tra forma ridotta e totale dei composti tiolici, e soprattutto del glutatione. Nel gruppo P miglioramento del rapporto tra forma ridotta e totale dei composti tiolici, e soprattutto del glutatione. RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO REDOX DI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE Rapporto R/T composti tiolici Gruppo P Gruppo NP T1T2T3T1T3 Cisteina R/T 0,290,370,440,260,31 Cisteinil-glicina R/T 0,360,510,620,540,57 Glutatione R/T 0,450,530,710,610,92 Perché aumenta la concentrazione di GSH ridotto?

15 RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO REDOX DEL GLUTATIONE ATTIVITA DELLA GLUTATIONE REDUTTASI Lieve incremento dellattività della glutatione reduttasi al termine della fase riperfusoria. Lieve incremento dellattività della glutatione reduttasi al termine della fase riperfusoria. Gruppo P Gruppo NP Gruppo P Gruppo NP

16 CONCLUSIONI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI 1.Consumo di glutatione e dei suoi precursori. La scarsità di glutatione potrebbe essere il fattore limitante lattività della glutatione reduttasi. La scarsità di glutatione potrebbe essere il fattore limitante lattività della glutatione reduttasi. 2.Condizione intracellulare di stress ossidativo, con miglioramento dello stato ossidoriduttivo del glutatione al termine della fase riperfusoria (mantenuta attività dellenzima glutatione reduttasi).

17 RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE Livelli basali preoperatori ridotti di GSH. Consumo nellimmediato postoperatorio, seguito da un progressivo recupero. Consumo nellimmediato postoperatorio, seguito da un progressivo recupero. Alterazioni più evidenti nel gruppo P. Alterazioni più evidenti nel gruppo P. Gruppo P Gruppo P Gruppo NP Gruppo NP Val. riferimento Val. riferimento Gruppo P Gruppo P Gruppo NP Gruppo NP Val. riferimento Val. riferimento

18 RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICI ATTIVITA DELLA GLUTATIONE REDUTTASI Notevole incremento dellattività dellenzima glutatione reduttasi nel postoperatorio. Notevole incremento dellattività dellenzima glutatione reduttasi nel postoperatorio. Gruppo P Gruppo P Gruppo NP Gruppo NP Val. riferimento Val. riferimento Gruppo P Gruppo P Gruppo NP Gruppo NP Val. riferimento Val. riferimento Campione tissutale

19 CONCLUSIONI: ANALISI SU CAMPIONI PLASMATICI Livelli scarsi di GSH a livello basale preoperatorio. Livelli scarsi di GSH a livello basale preoperatorio. Nelle giornate postoperatorie si assiste ad un progressivo incremento della concentrazione plasmatica di GSH e precursori, e ad un miglioramento del loro stato ossidoriduttivo (notevole aumento dellattività della glutatione reduttasi). Nelle giornate postoperatorie si assiste ad un progressivo incremento della concentrazione plasmatica di GSH e precursori, e ad un miglioramento del loro stato ossidoriduttivo (notevole aumento dellattività della glutatione reduttasi).

20 CONCLUSIONI 1.Riscontro a livello preoperatorio di scarse riserve intracellulari di glutatione. 2.Consumo di precursori del glutatione, che impedisce la produzione del glutatione stesso. 3.Condizione intracellulare di stress ossidativo, con miglioramento dello stato ossidoriduttivo nelle giornate postoperatorie. 4.Simile trend di modifica delle concentrazioni tissutali e plasmatiche di GSH e precursori.


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