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La biologia molecolare nella diagnostica virologica Corso di perfezionamento Nuovi sviluppi nella diagnostica microbiologica e virologica.

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Presentazione sul tema: "La biologia molecolare nella diagnostica virologica Corso di perfezionamento Nuovi sviluppi nella diagnostica microbiologica e virologica."— Transcript della presentazione:

1 La biologia molecolare nella diagnostica virologica Corso di perfezionamento Nuovi sviluppi nella diagnostica microbiologica e virologica

2 Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Tipo di metodo Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti

3 Ricerca delle sequenze nucleotidiche Quali virus ? difficilmente o non coltivabili (HBV, HCV, papillomavirus, parvovirus B19) a lento sviluppo (CMV, BKV, JCV) pericolosi da coltivare (HIV) emergenti (TTV)

4 Ricerca delle sequenze nucleotidiche Quando ? campioni con la carica virale molto bassa (liquor – HIV, HSV, JCV) distinzione tra infezione latente e attiva (CMV, HSV) riduzione “periodo finestra” (HIV, HCV) monitoraggio delle infezioni croniche  valutazione prognostica monitoraggi terapeutici genotipizzazione

5 Ricerca delle sequenze nucleotidiche Ibridazione sequenze bersaglio amplificazione  ibridazione sequenze bersaglio

6 reazioni bimolecolari fra una molecola bersaglio (target) e una molecola sonda (probe), in cui catene complementari di acidi nucleici si associano a formare molecole a doppia catena Ibridazione degli acidi nucleici

7 Sonde (probes) acidi nucleici purificati e clonati in vettori genetici oligonucleotidi di sintesi sonde generiche o specifiche dotate di un sistema di rivelazione sequenze di DNA o di RNA complementari alla sequenza bersaglio che si vuole cercare Sonde “calde” 32P, 35S  visualizzazione dell’ibrido tramite autoradiografia Sonde “fredde” Fluorochromi Biotina Digossigenina fluorescenza sistemi immunoenziamtici o enzimatici rivelazione colorimetrica o chemiluminescente

8 sistema di rivelazione detection in gene probe assays: (a) enzyme-labeled gene probe (b) hapten-labeled gene probe detected with labeled anti-hapten antibody (c) unlabeled gene probe and hybrid detection by means of anti-hybrid antibody and labeled anti-species antibody

9 Sistema enzimaticoSistema immunoenzimatico

10 Ibridazione in soluzione con successiva cattura dell’ibrido su matrice solida membrana (dot-blot, gel-blot), micropiastra in situ all’interno di cellule, con mantenimento della morfologia cellulare e tessutale

11 Hybrid Capture II HPV PROBE A: pool di sonde a RNA per HPV-LR: 6, 11, 42, 43 e 44 HPV PROBE B: pool di sonde a RNA per HPV-HR: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68 Denaturazione IbridazioneCatturaRivelazione Acquisizione ibridazione in fase liquida, cattura su pozzetto rivelazione chemiluminescente Sensiblità copie

12 Ibridazione sul filtro (dot-blot) 32P  autoradiografia dig  coniugato  Dig  AP  X-fosfato + NTB

13 Rivelazione multicolore

14 Metodi di amplificazione metodo substratothermal cycling PCRtarget DNAsi RT-PCRtarget RNAsi NASBAtarget RNAno LCRsondasi Q  sondano bPCRsegnaleno

15 amplificazione del DNA target Polymerase Chain Reaction (PCR) Master mix-4 dNTP -DNA polimerasi termostabile -2 oligonucleotidi (primers) denaturazione appaiamento volte estensione amplificazione di una sequenza di DNA compresa tra due brevi sequenze definite

16 Polymerase Chain Reaction (PCR)

17 Rivelazione dei prodotti amplificati presenza della banda dimensioni della banda Conferma della specificità - sequenziamento - Southern blotting - analisi con enzimi di restrizione

18 DdeI HaeIII DdeI HaeIII M : Sabin 1 2: Sabin 2 3: Sabin 3 M: bp ladder Rivelazione e identificazione di virus polio mediante RT-PCR e tipizzazione mediante RFLP : Sabin 1 2: Sabin 2 3: Sabin 3 4: “0” RNA 5: virus polio 1 di isolamento clinico 6: virus polio 2 di isolamento clinico 7: virus polio 3 di isolamento clinico 8: pb ladder 480 pb

19 PCR/ELISA ampliWell Parvo ID (Microgen) sensibilità: 10 UI standard internazionale (WHO): 1 UI  1 genoma Possibilità di quantificare il prodotto PCR/ELISA ampliWell Parvo ID (Microgen) sensibilità: 10 UI standard internazionale (WHO): 1 UI  1 genoma Possibilità di quantificare il prodotto Rivelazione dei prodotti amplificati

20 DEIA (Sorin Biomedica) Rivelazione dei prodotti amplificati

21 Rivelazione dei prodotti AMPLICOR® Microwell Plate Test Format

22 Rivelazione dei prodotti Hybridization Protection Assay (Gene-Probe) sonde marcate con estere di acridinio (AE) reattivo di selezione idrolizza AE delle sonde libere La luce emessa da AE protetto rilevata con luminometro

23 Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR singola PCR nested PCR multiplex RT-PCR Q-PCR (real time PCR) Reazioni più comunemente usate nel laboratorio diagnostico

24 PCR nested maggiore specificità maggiore sensibilità amplificazione mediante 2 PCR consecutive:

25 PCR multiplex Identificazione di bersagli differenti in una sola reazione virus differenti sequenze differenti dello stesso virus Duplex PCR per polyomavirus umani BK e JC

26 RT-PCR Trascrittasi inverse Moloney murine lekemia virus (M-MLV) Avian myeloblastosis virus (AMV) Tth DNA polimerasi - attività di trascrittasi inversa - attività di DNA polimerasi amplificazione RNA virale genomico mRNA virali (non distingue tra DNA e RNA)

27 RT/PCR per VP1/ mRNA del parvovirus B19 primers B19/9 5’ GTT TTT TGT GAG CTA ACT AAC A 3’ B19/9B 5’ CCA CGA TGC AGC TAC AAC TT 3’ prodotti ottenuti: 131pb, 251pb, 1615pb B19/9 B19/9B Unità di mappa

28 RT/PCR per VP1/mRNA del parvovirus B (1) MWM VI Roche; (2) cellule non infettate (controllo negativo); (3) tempo 0; (4) 24 ore ; (5) 48 ore; (6) 6 giorni; (7,10) campioni bianchi; (8,9) diluizioni scalari della sequenza bersaglio clonata.

29 amplificazione del target RNA Nucleic Acid Sequence – Based Amplification (NASBA) prima reazione di amplificazione alternativa alla PCR (1989) TAS = Transcription - based Amplification System 3SR o SSSR = Self Sustained Sequence Replication amplificazione selettiva dell’RNA attraverso cicli ripetuti di retrotrascrizione e di trascrizione Primer antisenso 5’ sequenza promotore per la T7 RNA polimerasi utilizza 3 enzimi-trascrittasi inversa AMV -T7 RNA polimerasi -Rnasi H Vantaggi (NASBA vs. RT/PCR) reazione isotermica sintesi selettiva del RNA: identificazione virus a RNA, identificazione della riattivazione dei virus latenti può essere utilizzata in versione quantitativa elevata sensibilià e specificità

30 Nucleic Acid Sequence – Based Amplification NASBA

31 amplificazione della sonda Ligase Chain Reaction (LCR) Master mix-DNA ligasi termostabile -4 oligonucleotidi -DNA polimerasi (Gap-LCR) Denaturazione Appaiamento, ligazione Amplificazione di prodotti di ligazione complementari alla sequenza bersaglio 25 volte

32 Ligase Chain Reaction (LCR) p1p2 p3p4

33 Ligase Chain Reaction (LCR) Gap – LCR

34 amplificazione della sonda Amplificazione con la Q  Replicasi Sonda sequenza complementare alla sequenza bersaglio + Q  RNA (MDV-1 RNA) Enzimi replicasi Q  = RNA polimerasi RNA dipendente in grado di duplicare la molecola Q  RNAsi III

35 amplificazione della sonda Amplificazione con la Q  Replicasi

36 ibridazione sandwich con una serie di sonde - sonde di cattura (capture probes) - sonde “leganti” (extender probes) - sonde di amplificazione ramificate (bDNA probes) - sonde marcate con enzima (reporter probes)

37 amplificazione del segnale Branched chain DNA (bDNA) Non richiede la purificazione del campione Non soggetta alle contaminazioni Segnale generato dal prodotto della reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla carica virale  applicazioni quantitative

38 Elevata sensibilità e specificità Ricerca di virus difficilmente o non coltivabili Identificazione e tipizzazione Quantificazione del prodotto Facile automazione Rapidità di esecuzione Elevata sensibilità e specificità Ricerca di virus difficilmente o non coltivabili Identificazione e tipizzazione Quantificazione del prodotto Facile automazione Rapidità di esecuzione Rischio di contaminazioni  falsi positivi Rischio di cross-reazioni con acidi nucleici non specifici Rischio di falsi negativi per inibitori Alti costi Rischio di contaminazioni  falsi positivi Rischio di cross-reazioni con acidi nucleici non specifici Rischio di falsi negativi per inibitori Alti costi vantaggi limiti Tecniche molecolari


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