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FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE. GENERAZIONE DI MUTANTI MUTAGENESI CHIMICA MUTAGENESI PER INSERZIONE.

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Presentazione sul tema: "FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE. GENERAZIONE DI MUTANTI MUTAGENESI CHIMICA MUTAGENESI PER INSERZIONE."— Transcript della presentazione:

1 FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE

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3 GENERAZIONE DI MUTANTI MUTAGENESI CHIMICA MUTAGENESI PER INSERZIONE

4 MUTAGENESI CHIMICA può essere condotta direttamente sui semi. MUTAGENI chimici radiazioni esteri dellacido etilmetansulfonico (EMS) caffeina, nicotina UV, raggi X radiazioni EMS alchila le G la G alchilata si appaia con T invece che con C Agenti alchilanti

5 MUTAGENESI PER INSERZIONE : TRASPOSONI, T-DNA

6 Vengono utilizzati semi maturi, con gli embrioni completamente sviluppati. Si trattano i semi con il mutageno Mutazioni a carico di una cellula producono una linea clonale di cellule mutate, durante il successivo sviluppo post-embrionale con il conseguente sviluppo di piante eterozigoti con settori mutanti. (M1) Solo se i settori mutati includono lo strato L2 del meristema apicale, da cui sarà generata la linea germinale della pianta matura, la mutazione passerà alla successiva progenie. I fiori mutanti produrranno (autofecondazione) il 25% di semi omozigoti riconoscibili per il loro fenotipo aberrante. MUTAGENESI CHIMICA DEI SEMI

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8 confronto tra mutagenesi chimica e mutagenesi per inserzione

9 MEDIANTE LA MUTAGENESI PER INSERZIONE IL GENE VIENE ETICHETTATO (GENE TAGGING), PERMETTEDONE UNA IDENTIFICAZIONE PIU AGEVOLE

10 Strategia di isolamento di mutanti Analisi dei mutanti Kan resistenti Propagazione delle piante T2 Analisi in vitro delle plantule Kan resistenti Ks Kr Raccolta semi T2 Autoimpollinazione Selezione in serra dei trasformanti T1 Raccolta semi T1 Trasformazione con T-DNA T0

11 T-DNAgene x Identificazione delle sequenze fiancheggianti il DNA inserito

12 PCR inversa primers T-DNA o DS

13 Digestione con EcoRI Recupero del plasmide GENE EcoRI RBLBOri Kan R T-DNA EcoRI RBLBpBR322 Kan R EcoRI T-DNA RBLBpBR322 Kan R EcoRI T-DNA EcoRI

14 Su terreno selettivo contenente Kanamicina cresceranno solo le colonie che hanno acquisito il plasmide Da queste sarà possibile recuperare il plasmide e sequenziarlo Ligazione Trasformazione E. coli Recupero del plasmide

15 Mutanti MONOPTEROS (MP) La mutazione produce piantine che mancano di ipocotile e radice ma che hanno la regione apicale Tuttavia la struttura delle regioni apicali non è normale e i tessuti dei cotiledoni sono disorganizzati Embrioni dI mutanti mp non formano il procambio nella parte basale dellembrione globulare, la regione che dà luogo allipocotile e alla radice I DIFETTI COMPAIONO NELLO STADIO DI OTTANTE

16 STADI DI SVILUPPO DI MONOPTEROS I mutanti bodenlos e AXR6 hanno un fenotipo simile a monopteros

17 Funzione del gene MONOPTEROS (formazione della radice embrionale) il meristema radicale (cq, columella) in Arabidopsis origina da una singola cellula: lipofisi Lipofisi si differenzia a partire da una cellula extraembrionale e ciò richiede lespressione di due geni: MONOPTEROS (MP) e BODENLOS (BD) I trascritti di MP e BD si accumulano in cellule del proembrione adiacenti alla cellula extraembrionale che si differenzierà in ipofisi MP e BD sono dei fattori di trascrizione coinvolti nella risposta allauxina MP appartiene alla classe dei fattori di trascrizione ARF (ARF5) regolatori positivi della risposta a IAA BD appartiene alla classe delle proteine IAA (IAA12) regolatori negativi della risposta allauxina

18 Destino differenziativo delle due cellule delembrione bicellulare cellula basale cellula apicale Il meristema apicale della radice ha unorigine mista

19 Regolazione dellespressione genica da parte dellauxina Geni di risposta primaria (geni precoci ): lespressione è indotta dalla attivazione di fattori di trascrizione già presenti (non è necessaria sintesi proteica) (oppure dalla inattivazione di inibitori della trascrizione preesistenti) Tali geni codificano per FATTORI DI TRASCRIZIONE i quali determinano lespressione dei Geni di risposta secondaria (geni tardivi) (Per lespressione di tali geni e quindi per la risposta è necessaria nuova sintesi proteica)

20 5 classi principali di geni precoci la cui trascrizione è indotta da IAA 1.Proteine AUX/IAA 2.Proteine SAUR 3.Proteine GH3 4.Glutatione S-trasferasi 5.ACC sintasi

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22 Le proteine AUX/IAA auxin response factors: ARF auxin responsive elements: TGTCTC

23 Regolazione dell espressione genica da parte dellauxina

24 IAA signaling: regolato dalla via del proteosoma /ubiquitina

25 Via del proteosoma/ ubiquitina E1 enzima attivante lubiquitina E2 enzima coniugante lubiquitina E3 enzima legante lubiquitina

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27 IAA: induce la trascrizione dei geni precoci promuovendo la degradazione di repressori AUX/IAA mediata dal PROTEOSOMA consentendo la formazione di dimeri ARF attivi Feedback negativo: tra i geni precoci indotti da IAA ci sono le proteine AUX/IAA

28 TIR1: proteina F-box (F-box N-terminale/LRR C terminale) E3: 4 subunità = Cullin1/Cdc53 Skp/ASK1 Rbx1/ROC1/Hrt1 F-box Mutante TIR-1

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31 In Arabidopsis: 23 ARF 28 AUX IAA La maggior parte delle AUX IAA funzionano come repressori della trascrizione di geni indotti da IAA Identificate 8 mutazioni in AUX IAA che influenzano lo sviluppo embrionale Sono tutte relative a mutazioni di singoli aacidi nel dominio II di degradazione delle proteine AUX IAA (proteosoma) Acquisizione di resistenza alla degradazione tramite la via del Proteosoma

32 BODENLOS (IAA12): il fenotipo dei mutanti assomiglia ai mutanti mp Codifica per una forma mutata di proteina AUX/IAA (IAA12) (repressore della risposta allauxina) La forma mutata è resistente alla degradazione mediata dal proteosoma e indotta dallauxina che è necessaria per la risposta differenziativa

33 I mutanti mp e bdl hanno difetti nel piano di divisione dellipofisi sebbene le proteine vengano espresse nelle cellule superiori adiacenti Meccanismo non-cell autonomous Cell to cell signaling

34 Modello per la formazione della radice embrionale: Lauxina si accumula nella ipofisi prima del suo differenziamento Questo accumulo richiede la localizzazione polare del carrier di efflusso PIN1 nelle cellule adiacenti del proembrione Lauxina è il segnale generato dallinterazione MP/BD PIN1 è espresso nelle stesse cellule in cui vengono espressi MP e BD

35 TGTCTC GUS (or GFP) The DR5 reporter construct is widely used to monitor auxin response-level. DR5 consists of seven repeats of an auxin-response element (AuxRE) which is a binding site for auxin-responsive transcription factors (ARFs). AuxRE Hours of staining Auxin-response level increases with exogenous auxin (NAA) Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., and Guilfoyle, T.J. (1997). Aux/1AA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9: Gene reporter

36 MP e BDL agiscono in maniera non-cell autonomous AUXINA (segnale primario nelle cellule adiacenti lipofisi) Rilascio di un segnale secondario nellipofisi AUXINA? (trattamenti con 2,4 D di bdl inefficaci) fattori di trascrizione TOM (targets of monopteros) espressi nellle stesse cellule di MP e BDL: TOM3 migra nellipofisi

37 MUTANTI AXR6 mostrano lo stesso fenotipo di mp e bdl AXR6 codifica per CULLIN 1 del complesso E3

38 Mutanti GNOM Piantine omozigoti gnom mancano di radici e cotiledoni I difetti nellembrione appaiono alla prima divisione dello zigote e rimangono per tutta lembriogenesi I mutanti più estremi sono sferici abolita completamente la polarità assiale GNOM necessario per la determinazione della polarità assiale

39 WT gnom SVILUPPO DEL MUTANTE gnom

40 Il fenotipo dei mutanti gnom è simile a quello dei doppi mutanti mpbdl Ridotta capacità di risposta allauxina? In embrioni di Brassica juncea il fenotipo gnom può essere fenocopiato con inibitori del trasporto di auxina

41 Funzione del gene GNOM GNOM codifica per un fattore di scambio GTP/GDP che si associa a piccole proteine G della classe ARF (ARF-GEF) Le proteine ARF (ADP ribosylation factor) sono coinvolte nella regolazione del trafficking intracellulare delle vescicole In Arabidopsis GNOM (EMB30) controlla la localizzazione del carrier per lauxina PIN1 durante lembriogenesi Mutazioni gnom aboliscono il trasporto polare dellauxina nellembrione

42 Complessi GEF-ARF ADP ribosilazione

43 Formazione di vescicole nel TGN

44 ARF serve a reclutare proteine di rivestimento sulle vescicole

45 Modello per il trafficking di proteine In Arabidospis

46 I geni GNOM determinano la distribuzione dei carrier di efflusso di IAA (proteine PIN) PIN1 TIBA e NPA (inibitori del trasporto di IAA) possono interferire con il riciclo di PIN

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48 The PIN proteins are named for the pin-formed mutant pin-formed, which has a mutation in the PIN1 gene, makes some abnormal leaves and then a bare inflorescence. Galweiler, L., Guan, C., Muller, A., Wisman, E., Mendgen, K., Yephremov, A., and Palme, K. (1998). Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue. Science 282: 2226 – 2230, reprinted with permission from AAAS.2226 – 2230

49 PIN auxin efflux carriers are encoded by a large gene family with cell-specific expression patterns Křeček, P., Skůpa, P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PIN- FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: PIN

50 PIN proteins orient asymmetrically in plant cells Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119: PIN1 localizes to the lower surface of root cortex cells Root Apex Root Base PIN1 is responsible for auxin flow from shoot apex to root apex.

51 PIN proteins orient differently PIN2 localizes to the lower surface of root cortex cells and the upper surface of epidermal cells. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119: PIN2 is functions primarily in the redistribution of auxin during root gravitropism

52 The distribution of PIN proteins contributes to the auxin gradients Křeček, P., Skůpa, P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PIN- FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10:

53 PIN protein distributions contribute to auxin- mediated patterns Reproduced with permission from Petrášek, J., and Friml, J. (2009) Auxin transport routes in plant development. Development 136: Amongst other things, they specify the location of auxin maxima necessary for embryonic patterning.

54 PIN proteins can move very dynamically within cells and tissues Unlike the more stably- oriented ABCB proteins, PIN proteins can rapidly change their positions within cells. Reprinted from Heisler, M.G., et al. (2005). Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15: 1899–1911, with permission from Elsevier.1899–1911

55 PIN proteins cycle between plasma membrane and endosome PIN proteins continually cycle between the plasma membrane and endosomal compartments. endosome Plasma membrane Redrawn from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21:

56 Brefeldin A blocks endocytosis and traps PIN proteins Brefeldin A (BFA) prevents endosomes from fusing with the plasma membrane, trapping PIN in the endosomal compartments. Control BFA treatment Redrawn and reprinted from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase- mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21:

57 The phosphorylation state of PINs affects their distribution PIN proteins are phosphorylated by the protein kinase PINOID (PID) and dephosphorylated by the protein phosphatase PP2A. PP PP2A PID PP PP Sukumar, P., Edwards, K.S., Rahman, A., DeLong, A., and Muday, G.K. (2009). PINOID kinase regulates root gravitropism through modulation of PIN2-dependent basipetal auxin transport in Arabidopsis. Plant Physiol. 150: Redrawn from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: ControlStaurosporine treated Staurosporine inhibits protein kinases

58 ABCB proteins may stabilize PIN proteins within membrane domains Titapiwatanakun, B., and Murphy, A.S. (2009) Post-transcriptional regulation of auxin transport proteins: cellular trafficking, protein phosphorylation, protein maturation, ubiquitination, and membrane composition. J. Exp. Bot : , by permission of the Society for Expiremental Biology ABCB19Plasma Membrane protein Orange = overlap The ABCB proteins seem to stay in the plasma membrane, unlike the PIN proteins. An interaction between the two transporters may contribute to stabilizing PINs.

59 LOCALIZZAZIONE DI PIN1 e PIN7 Stadio precoce Stadio globulare IAA

60 Localizzazione di PIN1 e PIN7 nello stadio precoce globulare e correlazione con la concentrazione di auxina

61 Localizzazione dellauxina nel mutante gnom

62 Mutanti GURKE Plantule omozigoti gurke sono prive dei cotiledoni mentre rimangono lipocotile e la radice Le plantule assomigliano a dei piccoli cetrioli (gurke) (pasticcino3)

63 Funzione del gene GURKE Il gene GURKE codifica per la acetil-CoA carbossilasi 1 (citosolica) I mutanti gurke possono essere complementati dallaggiunta di malonato

64 Complementazione della mutazione acc1 (gurke like) con malonato embrioni immaturi di arabidopsis espiantati dalla siliqua e coltivati in vitro 3 mM malonato

65 Sviluppo di embrioni del mutante pasticcino3 (gurke like) durante la germinazione complementazione da malonato 1mM malonato

66 ACCasi: catalizza la formazione di malonil-Coa da Acetil-Coa e CO 2 2 forme: citosolica (omodimerica): allungamento acidi grassi >20C plastidiale (eteromerica): sintesi acidi grassi Biosintesi degli acidi grassi malonilCoA sintetasi malonato + CoA malonilCoA

67 I VLCFA vengono incorporati negli sfingolipidi La ACC1 (citosol) serve alla biosintesi degli acidi grassi a lunghissima catena (VLCFA =>20) Contenuto di acidi grassi di semi di arabidopsis WT e mutanti Le mutazioni acc1-1; acc1-2; gurke; pas3 sono alleliche I mutanti hanno un accumulo ridotto di VLCFA nei semi

68 Nei mammiferi è stato visto che gli sfingolipidi interagiscono col colesterolo per formare domini raft- like ed hanno un ruolo nella regolazione della divisione cellulare

69 LIPID RAFTS: microdomini di membrana ricchi di colesterolo Dal 1972 (modello del mosaico fluido) si riteneva che fosfolipidi e proteine fossero simmetricamente distribuiti nelle membrane cellulari Nel 1988 K Simons (EMBL) e G van Meer (Utrecth) ipotizzarono lesistenza di microdomini arricchiti in colesterolo, glicolipidi e sfingolipidi Alcune proteine associate a processi di signaling sembrano localizzarsi preferenzialmente nei lipid rafts doubly-acylated tyrosine kinases of the Src familytyrosinekinasesSrc ACILAZIONE Alcune di queste proteine si associano ai LR solo quando sono nello stato attivato B cellB cell receptors (BCRs), T cell receptors (TCRs)T cell receptors

70 Mutanti FACKEL: Le mutazioni nel gene FACKEL determinano la delezione della parte centrale delasse apicale-basale Mutanti fackel hanno i cotiledoni uniti direttamente alla radice

71 Funzione del gene FACKEL (FK): Codifica per una sterolo C-14 reduttasi biosintesi degli steroli In arabidopsis i livelli di sitosterolo campestrolo, stigmasterolo e brassinolide sono ridotti nei mutanti fk

72 mg/ml fenpropimorph mutante fk Le mutazioni fk possono essere fenocopiate dal fenpropimorph, un inibitore della C-14 reduttasi

73 Mutazioni fk non sono complementate dallaggiunta di brassinolidi gli steroli ( CH, ER, ST,) che si accumulano nei mutanti fk responsabili degli effetti? trattamenti con CH, ER, ST dovrebbero FENOCOPIARE i mutanti fk

74 Non hanno difetti embrionali pur avendo livelli ridotti di steroli Mutanti BR sono complementati da BRs Mutanti fackel no

75 STEROLI Componenti della membrana cellulare influenzano permeabilità e fluidità della membrana e lattività di proteine animali: colesterolo piante: sitosterolo, campestrolo Precursori degli ormoni steroidei animali: androgeni, estrogeni, glucocorticoidi piante: brassinosteroidi

76 STEROLI ANIMALI Essenziali per lo sviluppo embrionale COLESTEROLO Negli animali evidenze che sia coinvolto in vie di trasduzione del segnale che controllano la formazione del pattern (Hedgehog (Hh) transduction pathway: proteine Hh secrete, modificate da colesterolo promuovono interazioni con altre proteine per la trascrizione dei geni delle cicline E e D)

77 Nelle piante PHABULOSA (PHB) è un fattore di trascrizione Leucin –Zipper Homeodomain possiede un domain di binding per steroli/lipidi. E implicato nel controllo della formazione del pattern radiale nel germoglio NELLE PIANTE GLI STEROLI POSSONO AVERE UN RUOLO NELLEMBRIOGENESI?


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