FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE

Presentazione sul tema: "FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE"— Transcript della presentazione:

1 FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE

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3 MUTAGENESI PER INSERZIONE
GENERAZIONE DI MUTANTI MUTAGENESI CHIMICA MUTAGENESI PER INSERZIONE

4 MUTAGENESI CHIMICA può essere condotta direttamente sui semi.
Agenti alchilanti esteri dell’acido etilmetansulfonico (EMS) caffeina, nicotina chimici MUTAGENI radiazioni UV, raggi X radiazioni a, b, g EMS alchila le G la G alchilata si appaia con T invece che con C

5 MUTAGENESI PER INSERZIONE: TRASPOSONI , T-DNA

6 MUTAGENESI CHIMICA DEI SEMI
Vengono utilizzati semi maturi, con gli embrioni completamente sviluppati. Si trattano i semi con il mutageno Mutazioni a carico di una cellula producono una linea clonale di cellule mutate, durante il successivo sviluppo post-embrionale con il conseguente sviluppo di piante eterozigoti con settori mutanti. (M1) Solo se i settori mutati includono lo strato L2 del meristema apicale, da cui sarà generata la linea germinale della pianta matura, la mutazione passerà alla successiva progenie. I fiori mutanti produrranno (autofecondazione) il 25% di semi omozigoti riconoscibili per il loro fenotipo aberrante.

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8 confronto tra mutagenesi chimica e mutagenesi per inserzione

9 MEDIANTE LA MUTAGENESI PER INSERZIONE
IL GENE VIENE “ETICHETTATO” (GENE TAGGING), PERMETTEDONE UNA IDENTIFICAZIONE PIU AGEVOLE

10 Trasformazione con T-DNA
Strategia di isolamento di mutanti Raccolta semi T1 Trasformazione con T-DNA T0 Raccolta semi T2 Autoimpollinazione Selezione in serra dei trasformanti T1 T2 Analisi in vitro delle plantule Kan resistenti Ks Kr Analisi dei mutanti Kan resistenti Propagazione delle piante

11 Identificazione delle sequenze fiancheggianti il DNA inserito
T-DNA gene x

12 PCR inversa T-DNA o DS primers

13 Recupero del plasmide GENE Digestione con EcoRI EcoRI RB LB Ori KanR
T-DNA Recupero del plasmide EcoRI RB LB pBR322 KanR T-DNA Digestione con EcoRI RB LB pBR322 KanR EcoRI T-DNA

14 Da queste sarà possibile recuperare il plasmide e sequenziarlo
Recupero del plasmide Ligazione Trasformazione E. coli Su terreno selettivo contenente Kanamicina cresceranno solo le colonie che hanno acquisito il plasmide Da queste sarà possibile recuperare il plasmide e sequenziarlo

15 I DIFETTI COMPAIONO NELLO STADIO DI OTTANTE
Mutanti MONOPTEROS (MP) La mutazione produce piantine che mancano di ipocotile e radice ma che hanno la regione apicale Tuttavia la struttura delle regioni apicali non è normale e i tessuti dei cotiledoni sono disorganizzati Embrioni dI mutanti mp non formano il procambio nella parte basale dell’embrione globulare, la regione che dà luogo all’ipocotile e alla radice I DIFETTI COMPAIONO NELLO STADIO DI OTTANTE

16 STADI DI SVILUPPO DI MONOPTEROS
I mutanti bodenlos e AXR6 hanno un fenotipo simile a monopteros

17 Funzione del gene MONOPTEROS (formazione della radice embrionale)
il meristema radicale (cq, columella) in Arabidopsis origina da una singola cellula: l’ipofisi L’ipofisi si differenzia a partire da una cellula extraembrionale e ciò richiede l’espressione di due geni: MONOPTEROS (MP) e BODENLOS (BD) I trascritti di MP e BD si accumulano in cellule del proembrione adiacenti alla cellula extraembrionale che si differenzierà in ipofisi MP e BD sono dei fattori di trascrizione coinvolti nella risposta all’auxina MP appartiene alla classe dei fattori di trascrizione ARF (ARF5) regolatori positivi della risposta a IAA BD appartiene alla classe delle proteine IAA (IAA12) regolatori negativi della risposta all’auxina

18 Destino differenziativo delle due cellule del’embrione bicellulare
cellula basale cellula apicale Il meristema apicale della radice ha un’origine mista

19 Regolazione dell’espressione genica da parte dell’auxina
Geni di risposta primaria (geni precoci): l’espressione è indotta dalla attivazione di fattori di trascrizione già presenti (non è necessaria sintesi proteica) (oppure dalla inattivazione di inibitori della trascrizione preesistenti) Tali geni codificano per FATTORI DI TRASCRIZIONE i quali determinano l’espressione dei Geni di risposta secondaria (geni tardivi) (Per l’espressione di tali geni e quindi per la risposta è necessaria nuova sintesi proteica)

20 5 classi principali di geni precoci la cui
trascrizione è indotta da IAA Proteine AUX/IAA Proteine SAUR Proteine GH3 Glutatione S-trasferasi ACC sintasi

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22 Le proteine AUX/IAA auxin response factors: ARF auxin responsive elements: TGTCTC

23 Regolazione dell’ espressione genica da parte dell’auxina

24 IAA signaling: regolato dalla via del
proteosoma /ubiquitina

25 Via del proteosoma/ ubiquitina E1 enzima attivante l’ubiquitina
E2 enzima coniugante l’ubiquitina E3 enzima legante l’ubiquitina

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27 IAA: induce la trascrizione dei geni precoci
promuovendo la degradazione di repressori AUX/IAA mediata dal PROTEOSOMA consentendo la formazione di dimeri ARF attivi Feedback negativo: tra i geni precoci indotti da IAA ci sono le proteine AUX/IAA

28 Mutante TIR-1 TIR1: proteina F-box (F-box N-terminale/LRR C terminale)
E3: 4 subunità = Cullin1/Cdc53 Skp/ASK1 Rbx1/ROC1/Hrt1 F-box

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31 In Arabidopsis: 23 ARF 28 AUX IAA La maggior parte delle AUX IAA funzionano come repressori della trascrizione di geni indotti da IAA Identificate 8 mutazioni in AUX IAA che influenzano lo sviluppo embrionale Sono tutte relative a mutazioni di singoli aacidi nel dominio II di degradazione delle proteine AUX IAA (proteosoma) Acquisizione di resistenza alla degradazione tramite la via del Proteosoma

32 BODENLOS (IAA12): il fenotipo dei mutanti assomiglia ai mutanti mp
Codifica per una forma mutata di proteina AUX/IAA (IAA12) (repressore della risposta all’auxina) La forma mutata è resistente alla degradazione mediata dal proteosoma e indotta dall’auxina che è necessaria per la risposta differenziativa

33 I mutanti mp e bdl hanno difetti nel piano di divisione dell’ipofisi sebbene le proteine
vengano espresse nelle cellule superiori adiacenti Meccanismo non-cell autonomous Cell to cell signaling

34 Modello per la formazione della radice embrionale:
L’auxina si accumula nella ipofisi prima del suo differenziamento Questo accumulo richiede la localizzazione polare del carrier di efflusso PIN1 nelle cellule adiacenti del proembrione L’auxina è il segnale generato dall’interazione MP/BD PIN1 è espresso nelle stesse cellule in cui vengono espressi MP e BD

35 Auxin-response level increases with exogenous auxin (NAA)
Gene reporter TGTCTC GUS (or GFP) Hours of staining Auxin-response level increases with exogenous auxin (NAA) AuxRE The DR5 reporter construct is widely used to monitor auxin response-level. DR5 consists of seven repeats of an auxin-response element (AuxRE) which is a binding site for auxin-responsive transcription factors (ARFs). Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., and Guilfoyle, T.J. (1997). Aux/1AA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9:

36 (segnale primario nelle cellule adiacenti l’ipofisi)
AUXINA MP e BDL agiscono in maniera non-cell autonomous Rilascio di un segnale secondario nell’ipofisi AUXINA? (trattamenti con 2,4 D di bdl inefficaci) fattori di trascrizione TOM (targets of monopteros) espressi nellle stesse cellule di MP e BDL: TOM3 migra nell’ipofisi

37 MUTANTI AXR6 mostrano lo stesso fenotipo di mp e bdl
AXR6 codifica per CULLIN 1 del complesso E3

38 Mutanti GNOM Piantine omozigoti gnom mancano di radici e cotiledoni
I difetti nell’embrione appaiono alla prima divisione dello zigote e rimangono per tutta l’embriogenesi I mutanti più estremi sono sferici abolita completamente la polarità assiale GNOM necessario per la determinazione della polarità assiale

39 SVILUPPO DEL MUTANTE gnom
WT gnom

40 Il fenotipo dei mutanti gnom è simile a quello dei doppi mutanti mpbdl
Ridotta capacità di risposta all’auxina? In embrioni di Brassica juncea il fenotipo gnom può essere fenocopiato con inibitori del trasporto di auxina

41 Funzione del gene GNOM GNOM codifica per un fattore di scambio GTP/GDP che si associa a piccole proteine G della classe ARF (ARF-GEF) Le proteine ARF (ADP ribosylation factor) sono coinvolte nella regolazione del trafficking intracellulare delle vescicole In Arabidopsis GNOM (EMB30) controlla la localizzazione del carrier per l’auxina PIN1 durante l’embriogenesi Mutazioni gnom aboliscono il trasporto polare dell’auxina nell’embrione

42 ADP ribosilazione Complessi GEF-ARF

43 Formazione di vescicole nel TGN

44 ARF serve a reclutare proteine di rivestimento sulle vescicole

45 Modello per il trafficking di proteine
In Arabidospis

46 I geni GNOM determinano la distribuzione dei carrier di efflusso di IAA
(proteine PIN) PIN1 TIBA e NPA (inibitori del trasporto di IAA) possono interferire con il riciclo di PIN

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48 The PIN proteins are named for the pin-formed mutant
pin-formed, which has a mutation in the PIN1 gene, makes some abnormal leaves and then a bare inflorescence. Galweiler, L., Guan, C., Muller, A., Wisman, E., Mendgen, K., Yephremov, A., and Palme, K. (1998). Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue. Science 282: 2226 – 2230, reprinted with permission from AAAS.

49 PIN auxin efflux carriers are encoded by a large gene family with cell-specific expression patterns
Křeček , P., Skůpa , P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PIN-FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249.

50 PIN proteins orient asymmetrically in plant cells
PIN1 localizes to the lower surface of root cortex cells Root Base PIN1 is responsible for auxin flow from shoot apex to root apex. Root Apex Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119:

51 PIN proteins orient differently
PIN2 localizes to the lower surface of root cortex cells and the upper surface of epidermal cells. PIN2 is functions primarily in the redistribution of auxin during root gravitropism Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119:

52 The distribution of PIN proteins contributes to the auxin gradients
Křeček , P., Skůpa , P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PIN-FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249.

53 PIN protein distributions contribute to auxin-mediated patterns
Amongst other things, they specify the location of auxin maxima necessary for embryonic patterning. Reproduced with permission from Petrášek, J., and Friml, J. (2009) Auxin transport routes in plant development. Development 136:

54 PIN proteins can move very dynamically within cells and tissues
Unlike the more stably-oriented ABCB proteins, PIN proteins can rapidly change their positions within cells. Reprinted from Heisler, M.G., et al. (2005). Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15: 1899–1911, with permission from Elsevier.

55 PIN proteins cycle between plasma membrane and endosome
PIN proteins continually cycle between the plasma membrane and endosomal compartments. Redrawn from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21:

56 Brefeldin A blocks endocytosis and traps PIN proteins
Brefeldin A (BFA) prevents endosomes from fusing with the plasma membrane, trapping PIN in the endosomal compartments. Control BFA treatment Redrawn and reprinted from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21:

57 The phosphorylation state of PINs affects their distribution
PIN proteins are phosphorylated by the protein kinase PINOID (PID) and dephosphorylated by the protein phosphatase PP2A. P PP2A PID Control Staurosporine treated Staurosporine inhibits protein kinases Sukumar, P., Edwards, K.S., Rahman, A., DeLong, A., and Muday, G.K. (2009). PINOID kinase regulates root gravitropism through modulation of PIN2-dependent basipetal auxin transport in Arabidopsis. Plant Physiol. 150: Redrawn from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21:

58 ABCB proteins may stabilize PIN proteins within membrane domains
Plasma Membrane protein Orange = overlap The ABCB proteins seem to stay in the plasma membrane, unlike the PIN proteins. An interaction between the two transporters may contribute to stabilizing PINs. Titapiwatanakun, B., and Murphy, A.S. (2009) Post-transcriptional regulation of auxin transport proteins: cellular trafficking, protein phosphorylation, protein maturation, ubiquitination, and membrane composition. J. Exp. Bot : , by permission of the Society for Expiremental Biology.

59 LOCALIZZAZIONE DI PIN1 e PIN7
Stadio precoce Stadio globulare IAA IAA

60 Localizzazione di PIN1 e PIN7
nello stadio precoce globulare e correlazione con la concentrazione di auxina

61 Localizzazione dell’auxina nel mutante gnom

62 Mutanti GURKE Plantule omozigoti gurke sono prive dei cotiledoni mentre rimangono l’ipocotile e la radice Le plantule assomigliano a dei piccoli cetrioli (gurke) (pasticcino3)

63 Funzione del gene GURKE
Il gene GURKE codifica per la acetil-CoA carbossilasi 1 (citosolica) I mutanti gurke possono essere complementati dall’aggiunta di malonato

64 Complementazione della mutazione acc1 (gurke like) con malonato
embrioni immaturi di arabidopsis espiantati dalla siliqua e coltivati in vitro 3 mM malonato

65 complementazione da malonato
Sviluppo di embrioni del mutante pasticcino3 (gurke like) durante la germinazione complementazione da malonato 1mM malonato

66 ACCasi: catalizza la formazione di malonil-Coa da Acetil-Coa e CO2
Biosintesi degli acidi grassi malonato + CoA malonilCoA sintetasi malonilCoA ACCasi: catalizza la formazione di malonil-Coa da Acetil-Coa e CO2 2 forme: citosolica (omodimerica): allungamento acidi grassi >20C plastidiale (eteromerica): sintesi acidi grassi

67 I VLCFA vengono incorporati negli sfingolipidi
La ACC1 (citosol) serve alla biosintesi degli acidi grassi a lunghissima catena (VLCFA =>20) I VLCFA vengono incorporati negli sfingolipidi Contenuto di acidi grassi di semi di arabidopsis WT e mutanti Le mutazioni acc1-1; acc1-2; gurke; pas3 sono alleliche I mutanti hanno un accumulo ridotto di VLCFA nei semi

68 Nei mammiferi è stato visto che gli sfingolipidi
interagiscono col colesterolo per formare domini raft- like ed hanno un ruolo nella regolazione della divisione cellulare

69 microdomini di membrana ricchi di colesterolo
LIPID RAFTS: microdomini di membrana ricchi di colesterolo Dal 1972 (modello del mosaico fluido) si riteneva che fosfolipidi e proteine fossero simmetricamente distribuiti nelle membrane cellulari Nel 1988 K Simons (EMBL) e G van Meer (Utrecth) ipotizzarono l’esistenza di microdomini arricchiti in colesterolo, glicolipidi e sfingolipidi Alcune proteine associate a processi di signaling sembrano localizzarsi preferenzialmente nei lipid rafts doubly-acylated tyrosine kinases of the Src family ACILAZIONE Alcune di queste proteine si associano ai LR solo quando sono nello stato attivato B cell receptors (BCRs), T cell receptors (TCRs)

70 Mutanti FACKEL: Le mutazioni nel gene FACKEL determinano la delezione della parte centrale del’asse apicale-basale Mutanti fackel hanno i cotiledoni uniti direttamente alla radice

71 Funzione del gene FACKEL (FK):
Codifica per una sterolo C-14 reduttasi biosintesi degli steroli In arabidopsis i livelli di sitosterolo campestrolo, stigmasterolo e brassinolide sono ridotti nei mutanti fk

72 mutante fk mg/ml fenpropimorph Le mutazioni fk possono essere fenocopiate dal fenpropimorph, un inibitore della C-14 reduttasi

73 Mutazioni fk non sono complementate dall’aggiunta di brassinolidi
gli steroli ( CH, ER, ST,) che si accumulano nei mutanti fk responsabili degli effetti? trattamenti con CH, ER, ST dovrebbero FENOCOPIARE i mutanti fk

74 Non hanno difetti embrionali pur avendo livelli ridotti di steroli
Mutanti BR sono complementati da BRs Mutanti fackel no

75 piante: sitosterolo, campestrolo
STEROLI Componenti della membrana cellulare influenzano permeabilità e fluidità della membrana e l’attività di proteine animali: colesterolo piante: sitosterolo, campestrolo Precursori degli ormoni steroidei animali: androgeni, estrogeni, glucocorticoidi piante: brassinosteroidi

76 STEROLI ANIMALI Essenziali per lo sviluppo embrionale COLESTEROLO Negli animali evidenze che sia coinvolto in vie di trasduzione del segnale che controllano la formazione del pattern (Hedgehog (Hh) transduction pathway: proteine Hh secrete , modificate da colesterolo promuovono interazioni con altre proteine per la trascrizione dei geni delle cicline E e D)

77 NELLE PIANTE GLI STEROLI POSSONO AVERE UN RUOLO NELL’EMBRIOGENESI?
Nelle piante PHABULOSA (PHB) è un fattore di trascrizione Leucin –Zipper Homeodomain possiede un domain di binding per steroli/lipidi. E’ implicato nel controllo della formazione del pattern radiale nel germoglio